第三章 男性不育相关检查

一、精液检测

（一）精液粗略估算

禁欲2～7天，精神状态良好，来院手淫取精液于洁净容器中，送实验室（若院外取精，至少1小时内）36℃恒温箱保存，待液化后判断精液外观、量、液化情况、黏稠度、酸碱度等，取一小滴精液滴于载玻片上，盖盖玻片，400倍光学显微镜下计数5～10个视野内精子数量和活率，平均值乘以106/ml，即粗略估算出精子的浓度。由于精子本身存在一定生理波动，再加上外界的干扰会影响精液检测的结果，如果精子存在问题，建议1周后，3周内再次复查有利于对结果的准确判断。

（二）精子存活率检测

1.意义：精液常规检测，无法区分死精子与不动精子，通过伊红Y染色可以测出活精子的正确比例。

2.原理：染料通过精子受损的细胞膜将精子染成红色，结构完整的精子不着色。

3.试剂：伊红Y500mg溶于100ml生理盐水即可。

4.操作步骤：取新鲜精液5ml滴于玻片上，加等量伊红Y染液混匀，盖盖玻片染色1min后光镜下观察。

5.结果计算：精子存活率=未着色精子数/计数精子总数

（一般计数200条精子，其中死精子呈红色，活精子不着色。）

（三）计算机辅助精液分析（CASA）

1.工作原理：精子形态图像和精子运动图像被CCD摄像头采集后，经视频输出口输入到监视器和计算机图像采集卡中，计算机相应的操作软件根据设定的精子大小和灰度、精子运动的位移及精子运动的其他有关参数，对采集到的图像进行动态分析处理。分析结果打印输出并保存。

2.操作步骤

（1）接通电源，依次打开主机电源开关、显微镜、监视器、录像机、恒温台、打印机及计算机；

（2）鼠标点击《动态分析系统》，输入检测对象的相关信息（姓名、年龄、编号、送检时间及精液的一般情况，同时测精液的pH）；

（3）将待检的精液10μl（微升）注入专用的精子计数板中，置于显微镜操作平台上，平衡1～3分钟；

（4）鼠标点击“活动显示”，调好焦距；

（5）鼠标点击“计算分析”，根据情况选择“中低密度”项或“高密度”项，调整灰度和域值大小使之尽量采集全部精子而不采集非精子成分，开始计算分析；

（6）进入计算分析状态后，重新分割新阈值（100～110）和中心阈值（12～16），计数圆细胞数，开始计算，采集数据，至少5个视眼，大于200条精子进行分析，数据修正，结束分析；

（7）全部保存，打印。

二、精浆生化检测

（一）α- 葡萄糖苷酶的测定（葡萄糖氧化酶法）

1.意义：精浆α-葡萄糖苷酶由附睾上皮细胞分泌产生，与精子的成熟和精子的运动密切相关，其在精浆中的含量可以反应附睾的功能。

2. 原理：麦芽糖有两个吡喃葡萄糖残基，由α-1，4糖苷键相连，经α-葡萄糖苷酶水解糖苷键可生成相应量的葡萄糖，再用葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖的生成量。

3.相关试剂：购自深圳华康生物医学工程有限公司。

4.操作方法

5.结果计算

α-葡萄糖苷酶（U/一次射精l）=详见酶标仪操作及结果计算。

参考值：≥20U/一次射精。

（二）精浆果糖的测定（吲哚法）

1. 意义：精浆果糖由精囊腺分泌产生，是精子代谢的能量来源，其降低会引起精子的活力低下，导致不育，对其的测定可以了解精囊腺的功能。

2. 原理：果糖与吲哚在强酸、加热环境中生成有色复合物，该物质在470nm波长有最大吸收峰，其吸光度大小与果糖含量成正比。

3.相关试剂：购自深圳华康生物医学工程有限公司。

4.操作方法

取精浆20ml，加稀释液200ml，加50ml去蛋白液，混合，加碱性溶液50ml，室温静置15min，2000r/min离心5min，取上清液备用。

将2.24mmol/L的果糖标准液向下稀释为1.12、0.56、0.28、0.14mmol/L四个浓度，上酶标仪制备标准曲线。

5.结果计算

果糖（mmol/一次射精）=详见酶标仪操作及结果计算

参考值：一次射精≥13mmol。

（三）精浆锌的测定（改良PAR法）

1. 意义：精液中锌是前列腺的功能指标之一，锌直接参与精子生成、成熟、激活和获能过程，对精子活力、代谢及其稳定性都有重要作用。

2. 原理：锌与吡啶偶氮间苯二酚在屏蔽剂的作用下，于pH9.5的反应体系中生成特异的锌—色原复合物，在470nm波长处有最大吸收峰，其吸光度大小与锌含量成正比。

3.相关试剂：购自深圳华康生物医学工程有限公司。

4.操作方法：精浆、标准品各40ml于微孔板内，然后分别加屏蔽剂200ml稀释，充分混匀。

5.结果计算

锌浓度（mmol/一次射精）：详见酶标仪操作及结果计算

参考值：一次射精≥2.4mmol。

（四）酶标仪操作及结果计算

α-葡萄糖苷酶：

将反应后的标本按下列排放：

置于酶标仪待测板处

开机（同时开启打印机），待酶标仪准备好后，按下列程序输入：

顺序输入5个标准值和位置

按开始键，完成。

结果计算：将测得的R值和RB值和精液量输入对应的位置，确认即可。

果糖：

将反应后的标本按下列排放：

置于酶标仪待测板处

开机（同时开启打印机），待酶标仪准备好后，按下列程序输入：

顺序输入5个标准值和位置

按开始键，完成。

结果计算：将测得的两个R值和精液量输入对应的位置，确认即可。

锌：

将反应后的标本按下列排放：

置于酶标仪待测板处

开机（同时开启打印机），待酶标仪准备好后，按下列程序输入：

按开始键，完成。

结果计算：将测得的空白值、标准值、测定值和精液量输入对应的位置，确认即可。

（五）精子顶体酶定量测定

1.意义：精子顶体是特化了的溶酶体，内含多种水解酶，顶体酶定量检测可以评价精子质量，是辅助诊断男性不育的有效指标。

2.相关试剂：购自深圳华康生物医学工程有限公司。

3.操作方法

将7.5/所测精子密度所得毫升数各加于T、C管，3000r/min，离心20min，弃去精浆

4.结果计算

精子顶体酶活性

5.参考标准：48.2～218.7μIU/106精子

6.注意事项

（1）精子分离后，一定要小心吸除上清液，不能丢失精子；

（2）溶酶剂4℃保存会出现结晶现象，使用前请37℃温育至完全溶解。

三、精液生精细胞检测

（一）意义

精液中生精细胞检查可反映睾丸生精功能情况，与精浆生化指标结合可鉴别阻塞性无精子症和非阻塞性无精子症。

（二）操作步骤

将精液洗涤后沉淀涂片，采用瑞—吉染色或Diff-Quik法染色。

（三）结果判断

1.精原细胞：在电镜下分A、B两型，A型体积小呈卵圆形，B型体积较大呈球形。染色，A型又分为Ad（暗A型）、Ap（亮Ap型），Ad型细胞核呈圆形、深染，核内染色质颗粒细小，在核中常显示大而淡染的胞核，有1～2个核仁；Ap型细胞核呈卵圆形，核内染色质颗粒粗大，不易被苏木精着色呈淡染，有1～3个核仁；B型核为圆形，核周有块状染色质，染色质颗粒着色浅，有1～2个核仁；

2.初级精母细胞：细胞体积比精原细胞大，初级阶段与B型精原细胞不易区分，随着生长，细胞质不断增多，体积增大，胞质丰富，直径＞18mm。核仁明显；

3.次级精母细胞：细胞体积小，呈圆形，直径12mm，核染色质呈网状，其在分裂间期停留时间很短；

4.精子细胞：形态多样，大小各异，其体积比次级精母细胞小，细胞呈圆形，核小而着色深，核旁有高尔基复合体，胞质内含有线粒体，呈颗粒状散在分布。

四、内分泌检测

男性生殖相关激素检测主要是FSH、LH、PRL、T、E2等，检测方法一般采用放射免疫测定法和化学发光检测。

FSH和LH均为糖蛋白激素，由共同的α-亚单位和各自特异的β-亚单位组成，β-亚单位决定激素的特异性，在垂体产生和分泌。它们的合成和分泌由下丘脑分泌的GnRH调节，同时还受T、E2的负反馈调节，睾丸合成分泌的抑制素和激活素等也参与它们的调节。FSH和LH呈脉冲式分泌，2小时左右一个脉冲，但性成熟男性一般在一个相对较窄的范围内波动。

PRL是一种蛋白激素，由垂体分泌，在T存在的条件下，促进男性前列腺和精囊腺的生长，增强LH对间质细胞的作用，使T合成增加。呈脉冲分泌，每天有14个脉冲波，基础分泌呈昼夜规律变化，中午最低，下午轻度升高，夜间入睡后显著升高，午夜至凌晨达高峰，上午逐渐下降，情绪、创伤等应激对检测结果影响大。

T是一种类固醇激素，由睾丸间质细胞合成和分泌，通过正负反馈和旁分泌调节体内的浓度，正常情况下睾丸内T浓度较外周血高百余倍，睾丸内高T浓度对精子的产生至关重要，外周血T主要参与机体的生理需要和内分泌的调节作用。T与白蛋白、性激素结合球蛋白和皮质醇结合蛋白等相结合形成结合睾酮，体内游离睾酮约占2%，研究发现具有生物活性的睾酮包括游离睾酮和清蛋白结合睾酮。

E2是一种类固醇激素，主要由雄激素在芳香化酶的作用下形成，据研究睾丸内雌激素浓度可高达万余pg/ml，较外周血高千余倍，在男性体内作用比较复杂，参与精子的形成、睾酮作用的协调等。

五、遗传学检查

遗传因素与严重少精子症和无精子症关系密切，且有影响下一代的风险，因此，针对精液严重异常的患者检查染色体就显得非常重要。

染色体是基因的载体，是组成细胞的基本成分，是染色质分裂周期中的一个阶段——中期。在染色体检查时，首先抽取外周血培养、积累分裂中期的细胞，将尽量多的细胞中止于中期，而不向分裂的后期和末期发展，再经过G显带或C显带制备成片，观察每一条染色体的情况，判断是否存在异常。

Y染色体微缺失是基因水平的测定，通过抽取外周血，提取DNA，根据设计的引物进行PCR扩增，电泳，观察是否存在基因缺失。具体每一区域缺失的意义见“男性不育临床疾病篇”。

六、免疫学检查

男性自胎儿、新生儿、青春期到成年的生殖复杂发育过程导致生殖系统具有多种抗原性，在正常情况下，有血睾屏障、精浆免疫抑制活性物质和免疫活性细胞的作用，不发生免疫反应。当血睾屏障被破坏和免疫功能障碍时就会产生针对生殖的免疫反应，从而通过损害精子的运动、阻止精子穿过宫颈黏液、抑制精子顶体的活性、胚胎毒性作用等影响生育。但是免疫因素对生育的影响必须是免疫问题存在生殖系统、作用于生殖系统才能影响生育。目前常用的检查方法有酶联免疫吸附实验（ELISA）、免疫珠法（IBT）、混合抗球蛋白反应实验（MAR）、精子凝集试验（TAT）、精子制动实验（SIT）等。下面简单介绍MAR检查。

1. 意义：用于男、女性不育患者的病因分析，为男、女性免疫性不育的诊断、治疗提供重要依据。

2.相关试剂：购自深圳华康生物医学工程有限公司。

3.操作方法：取新鲜液化的精液标本10μl于载玻片上，加10μl乳胶抗原充分混匀，再加10μl抗血清亦充分混匀，盖上盖玻片，置（37℃）5min，显微镜下观察结果。

4.结果判断

（-）：活精子在乳胶颗粒之间自由游动；

（+）：活精子与乳胶颗粒黏附凝集在一起百分率在10%～25%；

（++）：活精子与乳胶颗粒黏附凝集在一起百分率在25%～50%；

（+++）：活精子与乳胶颗粒黏附凝集在一起百分率在50%～75%；

（++++）：活精子与乳胶颗粒黏附凝集在一起百分率大于75%。

5.注意事项：试剂切忌冷冻，使用时应恢复至室温并摇匀。

七、生殖系统B超

由于超声检查的敏感性及其方便、易行的特点，已经成为阴囊内疾病最常用的辅助检查手段。同时由于现代超声技术的发展，高分辨率的机器能探测到小至1mm的病变，因此，在对由于各种原因如阴囊外伤、疼痛、不育、对侧睾丸肿块、附睾肿块、鞘膜积液、不明原因腹膜后肿块患者进行阴囊超声检查时有可能发现一些临床上体检未能扪及的睾丸肿块。

近几年比较热门的是睾丸微石症，男性不育症中发病率6.2%，以输精管内钙质沉积为特征，多双侧睾丸同时累及，早期曾认为是一种良性疾病，目前认为有发生睾丸肿瘤的倾向。