1.3 实时荧光定量PCR检测技术

以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。传统的定量PCR有很多，如倍比稀释法、内参照法、竞争法、PCR-ELISA法等，但这些定量PCR技术操作时的劳动强度大，而且只能对PCR的终产物进行分析，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差，无法直接从终点产物量推算出起始模板量。因此传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

所谓实时荧光定量PCR技术就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析[102]。该技术自1996年由美国Applied Biosystems公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。与常规PCR相比，它具有特异性更强、自动化程度高等特点，能有效解决PCR污染问题，目前已得到广泛应用，涉及的范围包括DNA和mRNA的绝对定量分析、基因表达差异分析、核酸多态性分析、基因突变分析等多个领域。

图1-6 Realtime PCR的扩增曲线

·Rn：一个反应管经n次热循环后，测得的荧光强度（NormalizedwithROX-参比染料）。

·Rn+：反应管含有模板DNA。

·Rn-：反应管不含有模板DNA。理想情况下，是一条平线，只具有背景荧光数值。

·Threshold：荧光（Rn）超过本底——达到可检测水平时的临界数值。

·Ct:thresholdcycle，临界循环数，threshold横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循环数。

·基线：baseline，是背景曲线的一段，范围从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景。引自：www.appliedbiosystems.com.cn

在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可与通过一个强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。一般而言，荧光扩增曲线可分成三个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量呈指数级增加，产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此选择这一阶段进行定量分析。

荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种[102]。探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加，该方法简便易行，适用于扩增序列非特异性检测。TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5′末端，而淬灭剂则在3′末端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3′端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5′外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。由于增加了探针的识别步骤，其特异性较高。常用的荧光基团是FAM、TET、VIC、HEX[103]。分子信标是一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记核苷酸探针。在发夹结果中，分子一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后不产生光子，而是将能量传递给淬灭剂。由于淬灭剂的存在，荧光基团产生的能量以红外的形式释放出来。分子信标要求在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。由于酶切作用的存在，分子信标也积累荧光。常用的荧光基团：FAM、TexasRed。PCR扩增程序通常是：94℃～55℃～72℃三步法，40个循环[102],[104]。SYBR Green I是一种能与双链DNA结合的染料[105]，与双链DNA结合后，荧光大大增强。在PCR反应体系中加入过量的SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR荧光染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。由于SYBR Green I没有特异性，对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，可能会有假阳性发生。但是由于它能与所有的双链DNA相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。这对科研是很有利的，因此，在国内外科研中使用比较普遍。

在实时荧光定量PCR中，有两种定量PCR的分析方法：相对定量和绝对定量。相对定量法是许多实时定量PCR研究分析方法的一种选择，指的是在一定样本中，靶序列相对于另一参照样本的量的变化，包括标准曲线相对定量法和比较CT法。在标准曲线相对定量法中的标准品只要知道其相对稀释度即可，靶序列的量来自于标准曲线，量的表达是相对于某个参照物的量而言的。绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本量，可以得到样本中基因的拷贝数和浓度。该方法要求标准品的量是已知的，常用质粒DNA和体外转入的RNA制备绝对定量标准品[106],[107]。

以往有研究采用实时定量PCR法检测SR-BI、LDL-R、StAR基因mRNA的表达，但数量有限，以“real-time quantitative RT-PCR”分别加上述基因为检索词在PUBMED上检索的结果是“real-time quantitative RT-PCR and SR-BI”2条、“real-time quantitative RT-PCR and LDL-R”9条、“real-time quantitative RT-PCR and StAR”4条。由于研究目的不同，不同研究者所检测基因的表达位置也不同，所检文献均未报道这些基因在睾丸Leydig细胞的表达。本研究首次采用TaqMan探针的实时荧光定量PCR法对运动性血睾酮降低时大鼠睾丸Leydig细胞上HMG-CoA还原酶、SR-BI、LDL-R、StAR基因mRNA的表达同时进行了检测。

近年来，实时荧光定量PCR技术逐渐被运动医学领域的研究所应用。目前，国内运动医学领域采用的定量PCR技术多为SYBRGreenI掺入法，属相对定量研究。如通过SYBRGreenI掺入法对骨髓转铁蛋白受体mRNA表达进行荧光定量检测，研究运动性贫血的发生机制[108]。通过SYBRGreenI掺入法研究低氧训练对大鼠海马低氧诱导因子及其调控相关基因mRNA表达的影响[109]。上海体育学院在国内首先使用绝对定量的实时PCR技术对运动员体内自发性IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和PFR进行了检测[106]。随着技术的不断改进和发展，实时荧光定量PCR技术以其高通量、高敏感性和准确性的特点为分子水平检测、评估运动员机能状态提供了简易、准确的研究手段，必将得到广泛应用，成为未来体育科研的主要工具。