任务五　蛋白质的分离与纯化

蛋白质分离与纯化是研究蛋白质化学组成、结构及生物学功能的关键。生物制药中蛋白类药物生产制备的关键技术是蛋白质的分离与纯化。所谓蛋白质分离纯化是从生物样本中提取具有生物活性及化学结构完整的特定蛋白质的过程。由于蛋白质种类繁多，在组织器官及细胞中含量极低，从复杂的体系中提取蛋白质，且要保持蛋白质的天然构象及生物活性是相当困难的。利用蛋白质物理化学性质及免疫学等的差异可以对蛋白质进行分离。目前，蛋白质分离与纯化的发展趋势是精细而多样化技术的综合运用，实际工作中应按不同的要求和可能的条件选用不同的方法。

一、蛋白质的提取

蛋白质的理化性质由氨基酸组成、数量以及序列决定，不同蛋白质其氨基酸组成有差异，其理化性质也存在差异，这是蛋白质分离的物质基础。由于大多数蛋白质位于细胞内，因此，要想成功提取细胞内的蛋白质，需要采取合适的方法进行破壁处理。细胞破碎后，蛋白质常与脂肪、糖以及核酸等结合，常用化学裂解液进行处理，如十二烷基磺酸钠（SDS）、Triton等。为避免蛋白质分离纯化过程中变性，常在低温条件下进行，如冰浴或4℃水浴中。蛋白质提取过程为：样本的选择→细胞破碎→蛋白质提取。

蛋白质提取时尽可能选择蛋白质含量较高的样本。如果由于研究目的的特殊需要，就只能根据研究的特殊要求选择特定的生物材料。胞外蛋白质可直接提取，若在细胞内，则需要破壁处理后再进行提取。由于动植细胞、微生物细胞结构不同，可采取合适的破壁方式。蛋白质在提取过程中，要避免细胞内外的蛋白酶对其降解。同时，也要注意提取条件对蛋白质构象及生物学活性的影响。稀盐和缓冲系统对蛋白质构象有稳定作用，且蛋白质溶解性也较好。提取过程中要注意提取液用量、提取温度和提取pH值等关键工艺参数。碱性蛋白质常用偏酸性提取液提取，而酸性蛋白质则用偏碱性提取液提取。

二、蛋白质的分离与纯化

（一）透析与超滤

透析是利用蛋白质生物大分子为胶体物质，不能穿透半透膜，而蛋白质溶液中的其他小分子可透过半透膜，从而实现蛋白质与杂质的分离。透析袋一般用超小微孔的膜如玻璃纸或醋酸纤维素膜制成，分子量低于10kDa的可透过微孔膜。用硫酸铵或氯化钠等中性盐盐析得到的蛋白质常用透析法除去中性盐。如果在袋外放入吸水剂（如PEG），透析袋内的水分随小分子流出，则可起到浓缩蛋白质的作用。

超滤是利用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留量的超滤膜，从而实现蛋白质溶液浓缩的目的。通过选择不同孔径的超滤膜，可实现不同分子量的蛋白质分离。超滤可选择性分离蛋白质、无相态变化、条件温和、不易变性，广泛应用于蛋白质溶液浓缩、脱盐和分级纯化等过程。

（二）低温有机溶剂沉淀法

低温有机溶剂沉淀法是在低温条件下，利用有机溶剂对蛋白质的沉淀作用进行蛋白质的提纯的操作。其原理是有机溶剂介电常数比较低，如20℃时，水为79，乙醇为26，丙酮仅为21。因此，丙酮常用作蛋白质有机溶剂沉淀溶剂。但需注意的是，丙酮沉淀操作通常在0～4℃下进行，丙酮用量为蛋白质样品的10倍。蛋白质经丙酮沉淀后，需立即分离，否则易变性。乙醇也是较为常见有机沉淀溶剂。如用冷乙醇法从血清分离制备人体清蛋白和球蛋白。

（三）盐析沉淀法

在盐析时，常用硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等中性盐。利用中性盐能中和蛋白质表面电荷和破坏水化膜，从而使蛋白质胶体溶液的稳定因素破坏，蛋白质出现聚沉。每种蛋白质盐析所需盐浓度和pH值不尽相同。如血清白蛋白溶于pH7.0的半饱和硫酸铵溶液，而血清球蛋白则在该溶液中沉淀析出。当硫酸铵达到饱和时，白蛋白也随之析出。盐析法常用于蛋白质的初步提纯，需与其他分离纯化方法联用才能保证获得高纯度蛋白质。一般情况下，单价离子的中性盐（NaCl）比二价离子的中性盐［（NH4）2SO4］对蛋白质溶解度的影响要小些。

（四）免疫沉淀法

蛋白质具有抗原性，与特异性抗体结合可形成免疫沉淀反应。利用特异性抗体可识别对应的抗原蛋白，并形成抗体-抗原复合体，从而从复杂的蛋白质混合液中分离纯化特异性的抗原蛋白，这种方法称为免疫沉淀法。在具体操作中，常将抗体交联至固定化的琼脂糖珠上，将含抗原的蛋白质混合液通过该柱子，从而获得特异性结合的抗原-抗体复合物。将复合物溶于含SDS和二巯基丙醇的缓冲液后加热，抗原可从复合物中分离出来。

（五）电泳法

当蛋白质溶液偏离pI时，蛋白质颗粒带有正电荷或负电荷，在电场中会向与其电性相反的电极泳动，这种因电荷性质、数量和分子量不同而在电场中泳动速度不同，进而实现蛋白质分离的技术，称为电泳。根据支持物不同可分为薄膜电泳和凝胶电泳两类。薄膜电泳以薄膜作为电泳支持物，如醋酸纤维素薄膜在临床中常用于血浆蛋白的电泳分析。凝胶电泳的支持物主要有琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）等。

1.十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

十二烷基磺酸钠（SDS）为常见阴离子表面活性剂，能断裂蛋白质分子内和分子间氢键，使蛋白质空间结构破坏，在蛋白质样品和凝胶中加入SDS后，蛋白质聚合物解聚为多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合形成蛋白质-SDS胶束，SDS所带负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，结合后能消除蛋白质本身所带电荷对电泳的影响。由于不同蛋白质-SDS胶束短轴长度都相同，蛋白质在电泳时，电荷和分子形状对电泳的影响可以消除，而仅取决于蛋白质的分子量。聚丙烯酰胺凝胶有分子筛效应，电泳分辨率高。如醋酸纤维素薄膜电泳分离人血清只能分出5～6种蛋白质成分，而SDS-PAGE可分出20～30种蛋白质成分，且样品需要量少，一般用1～100μg即可，常用于蛋白质分子量测定。

2.等电聚焦电泳

等电聚焦电泳（isoelectric focusing electrophoresis，IFE）是利用在凝胶中加入人工合成的两性电解质，电泳时形成一个由阳极到阴极逐渐增加的pH梯度，蛋白质在其等电点相应的pH区域实现分离，分辨率极高，蛋白质pI相差0.01pH单位可完全分开，是分离蛋白质等两性物质的重要分离纯化和分析方法。常用电解质Ampholine是人工合成的含多氨基和多羧基的脂肪族混合物，具有导电性能好、在电场中分布均匀、水溶性好、缓冲能力强、紫外吸收低、易从聚集蛋白质中洗脱等优点。根据蛋白质的特点可以选择较宽pH梯度范围（pH3～10）的两性电解质，也可选择pH梯度范围较窄（pH7～8）的两性电解质，两性电解质pH范围越小，分辨率越高。利用IFE，可从人血清蛋白中分离出40～50种蛋白质组分，而一般的PAGE仅能分离出20～30种蛋白质。在PAGE中为一条带的蛋白质，在IFE中表现为3个区带。IFE主要用于蛋白质的分离分析，也可用于高纯度蛋白质的制备，成本较高，但操作简单，分辨率极高，也可用于未知蛋白质等电点的测定。将已知等电点的标准蛋白质与未知蛋白质同时进行IFE，并根据标准蛋白质区带到凝胶某一侧的距离作标准pI曲线，然后通过标准曲线可测定未知蛋白质样品的pI。IFE主要采取水平平板电泳，常采用低浓度的PAGE（如4％）薄层电泳。

3.聚丙烯酰胺凝胶双向电泳

聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2-D PAGE）是将IEF和SDS-PAGE结合起来的一种电泳技术，是当前获得组织细胞内蛋白质表达情况的重要手段。在混合蛋白质中，只要pI和分子量有差异的均可以实现分离，分辨率极高，可直接检测细胞内某特定蛋白质的表达。如蛋白质mRNA转入到青蛙卵母细胞中，通过对转入和对照细胞蛋白质提取液进行双向电泳，对比分析图谱可鉴定mRNA转入后产生的特异性蛋白质，可直接检测mRNA的表达情况。

双向电泳第一向为IEF（等电点信息），第二向为SDS-PAGE凝胶电泳（分子量信息）。将IEF分离后的凝胶紧贴在SDS-PAGE上面，即可进行第二向电泳。第二向电泳主要根据蛋白质分子量进行分离，经第一向和第二向分离后，蛋白质将根据等电点和分子量显示在双向图谱中。细胞提取液经双向电泳后可分离1000～2000个蛋白质。双向电泳是目前所有电泳技术中分辨率最高、信息量最多的技术，广泛应用于蛋白质组学的研究。

聚丙烯酰胺凝胶双向电泳分为蛋白质样品的制备、IEF和SDS-PAGE、凝胶染色与显色、二维图谱的分析等过程。蛋白质样品要经过变性、还原等手段破坏蛋白质之间的相互作用力，去除非蛋白成分（如核酸）、IEF完成后要在含SDS缓冲液中平衡30min，以保证二向电泳时组分的均匀性，提高蛋白质的转移效率。

（六）色谱法

由于待分离蛋白质分子量、电荷及亲和力等不同，当待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固定相时，待分离蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相，从而分离蛋白质。常用色谱方法有凝胶过滤色谱和亲和色谱等。

1.凝胶过滤色谱

也称分子筛色谱，适用于各类生化物质，如肽、激素、蛋白质、多糖、核酸等的分离纯化、脱盐、浓缩以及分子测定等，分离范围较宽，Sephadex G分离分子量范围为102～105，Sepharose类为105～108。其分离原理是通过凝胶的分子筛效应，利用蛋白质分子量的差异实现蛋白质的分离，分离原理见图2-18。一般采用葡聚糖凝胶。葡聚糖凝胶是以葡聚糖与交联剂形成网状结构物，孔径大小用G表示。G越小，交联度越大、孔径越小。大分子蛋白质被排阻于胶粒之外。小分子蛋白质则进入凝胶分子内部。在色谱柱洗脱时，大分子受阻小而最先流出，小分子受阻大而最后流出。

2.亲和色谱法

又称选择色谱、功能色谱或生物特异吸附色谱，是利用共价键连接有特异配体的色谱介质来分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目标蛋白质或其他分子的色谱分离技术。在某些生物分子结构中有能与其他分子识别并结合的位点，如酶的活性中心与底物的识别结合，抗体与抗原的特异性结合，受体与配体的识别结合等。配体与待分离物具特异结合能力，即具有亲和性，基于这种具有特异亲和力的化合物之间能可逆结合与解离的性质建立的色谱方法称为亲和色谱法。常用亲和配体有底物类似物、抑制剂、辅酶等。抗体常作为抗原、病毒和细胞纯化的亲和配体，凝集素常作为糖蛋白纯化的亲和配体，核酸互补碱基序列常用于DNA聚合酶或RNA聚合酶、核酸结合蛋白等的配体，金属离子常用于聚组氨酸融合蛋白表面含组氨酸、半胱氨酸和（或）色氨酸残基的蛋白质纯化的配体。本法具有简单、快速、纯化倍数高等显著优点，是一种高度专一性分离纯化蛋白质的有效方法，亲和色谱分离的原理见图2-19。

（七）超速离心法

离心力常用地球引力的倍数表示，也称相对离心力（RCF），表示为数字乘以“g”（0.98m/s2），如1000g。相对离心力与每分钟转速的关系为RCF=1.119×10-5×（r/min）2R，R为离心机转头半径。离心机转头通常都配有相互转换表格。如果用r/min表示离心力大小时，必需指出离心机的品牌及转头型号，而RCF与离心机转头半径无关。一般真核细胞在1000g离心5min即可沉淀，核糖体蛋白质需在100000g离心3h以上才能沉淀。颗粒物质越小，离心沉淀所需的离心力就越大。

普通离心机的RCF一般为5000～6000g，可用于组织碎片、真核细胞等大颗粒物质的分离。高速冷冻离心机RCF一般为80000～90000g，可在0～4℃条件下进行低温冷冻离心，常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、盐析沉淀和抗体-抗原免疫沉淀等颗粒物的分离。超速离心机其RCF可达到500000～600000g，可用于核酸、病毒、蛋白质和多糖等的分离。普通低速离心机对称离心管允许的重量误差在0.1g左右，而高速冷冻离心机和超速离心机则要求误差在0.01g以下。

超速离心法既可以用来分离纯化蛋白质，也可以用于测定蛋白质的分子量。蛋白质在离心场中的行为用沉降系数（sedimentation coefficient，S）表示。沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。