1.5　荧光和磷光光度法简史

由以上讨论可见，发光是一个很广泛的概念。而在此发光主要指物质与光辐射相互作用后的次级光辐射现象，分子荧光和磷光发光是典型代表。

中国关于发光（磷光）的记载非常早，先秦有“町疃鹿场，熠耀宵行”的诗句，《史记》有类似夜明珠的记载，淮南王刘安的《淮南子·汜论训》有“老槐生火，久血为燐”描述，晋有囊萤映雪的励志故事。而王充在《论衡·论死篇》对“燐”有朴素的理解：“人之兵死也，世言其血为燐。血者，生时之精气也。人夜行见燐，不象人形，浑沌积聚，若火光之状。燐，死人之血也。”中国古代把这些现象称为鬼火，或燐光。这些现象直到西方真正的化学科学诞生才得到合理的解释（低燃点PH3和P2H4的浅蓝绿火焰）。

根据我国的化学元素命名原则，固态的非金属元素名称从石字旁，“磷”作为元素名称就这样约定而成了。从此“燐”就写作“磷”了。大概因此，“燐光”也就写为“磷光”了。当然，如果把“燐光”理解为“燐”（特指磷氢化物或膦的燃烧现象），那么用“磷光”（phosphorescecne）来表示光谱学中的发光现象的确更合适。

而在西方，直接的荧光和磷光观察、记录、机理探索也有400多年的历史了。其中一些重要的或有趣的历史节点事件叙述如下。

1565年，西班牙内科医生Nicholás Monardes观察到，在一种产于墨西哥的现在叫做紫檀木（Lignum nephriticum，菲律宾紫檀木）的木制杯中泡制过的水，会发出一种神奇迷人的蓝光，如图1-1所示。在那个时候，该浸泡液体被用于处理肾脏或泌尿系统疾病，而且能发蓝色光的液体效果最佳，这种光后来才叫做荧光[1,2]。近些年，Acuña等[3]重新仔细研究鉴定了这种菲律宾紫檀木泡制液主要的发光组分Eysenhardtia polystachya，如图1-2所示。它实际上并不存在于植物中，而是树黄酮类化合物非同寻常的自氧化所致。这是西方学者认为的最早的关于荧光现象的记录材料。但也有化学史学家报道了更早的有关发光现象的记载[2,4]。

图1-2　菲律宾紫檀木水泡制液的荧光化合物的结构和形成过程

1602年，V. Cascariolo（鞋匠、炼金术士）发现一种叫做Bolognian stone的著名磷光体，即一种天然的意大利重晶石（BaSO4），其炼烧产物可以发光，此乃第一次有关磷光的报道。重晶石发射的磷光可能源于由重晶石煅烧产生的BaS中掺杂的Bi或Mn等掺杂离子：硫酸钡→煅烧还原→掺杂硫化钡→太阳光辐射→红光发射。图1-3为硫酸钡晶体和典型重晶石矿的照片。

图1-3　硫酸钡晶体和重晶石矿石照片

1819年，剑桥大学矿物学家Edward D. Clarke教授报道了一些非常漂亮的含氟晶体，它在不同条件下可以产生两种颜色。

1822年，法国矿物学家R. J. Haüy注意到双色发光的氟化物晶体——萤石，如图1-4所示，当时认为是一种蛋白石（opal）发光。而如今萤石晶体本身的颜色也得到了很好的解释。而蛋白石是一类含有不同发光或不发光矿物质的二氧化硅凝胶，现在看来，蛋白石发光（opalescence）也是一种散射光。图1-5展示了一种产于秘鲁的蓝色蛋白石工艺品。

图1-4　日光辐射（a）和UV灯辐射（b）下的绿色萤石孪晶[2]

注：萤石呈现明显的双色。纯的萤石无色无荧光；天然的萤石含有许多稀土元素，绿色大概源于Sm2+吸收蓝色和红色光。深蓝区域源于Eu2+荧光，其发光能态涉及7个未成对电子，因此它们的自旋多重度为8。Sm和Eu两种元素作为杂质，含量在10～100 µg/g

1833年，D. Brewster发现，阳光辐射透过绿色的叶绿素乙醇萃取液，在侧向观察到漂亮的红色荧光。并指出，这种光发射与萤石晶体的蓝光具有相似性，原因也是归于上述Haüy提到的蛋白石发光。

1842年，法国物理学家Edmond Becquerel在紫外段阳光辐射下，通过观察沉积在纸上的硫化钙的磷光发射指出，发射光波长比入射光波长更长[2]。

图1-5　两种蛋白石工艺品

1845年，Sir John Frederick William Herschel首次观察到奎宁在450 nm发射的蓝色荧光。

1852年，George Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时发现，它们的发光波长要比入射光的波长更长。首次阐明这种现象是由于物质吸收了光后重新发出不同波长的光，Stokes称其为荧光。相比于Becquerel在1842年提出的关于发射光波长更长的相似结论，Stokes所描述和定义的是荧光，而Becquerel所观察到的是磷光。不过荧光和磷光都属于光致发光，并没有实质上的区别。此外，Stokes还发现了光强度与物质的浓度成正比，并对荧光的猝灭及自猝灭现象做了研究，提出了应用荧光进行定量分析的可能。图1-6为Stokes研究荧光现象的实验装置示意图以及Stokes的肖像照片。

图1-6　Stokes观察荧光的实验装置示意图（a）及其肖像照片（b）（George Gabriel Stokes，1819—1903）

1868年，F. Göppelsröder利用Al3+-桑色素配位作用引起的荧光颜色变化，首次实现定量分析工作，见图1-7。

图1-7　桑色素（morin，3,5,7,2′,4′-五羟黄酮）与铝离子的配合导致荧光增强机理

1944年，G. N. Lewis及其学生M. Kasha证实磷光起源于三线态跃迁，即T1-S0跃迁[5]；也就是说，自此，磷光被认为是来源于一个实在的本征的电子能级，而不再是人们曾经所猜测的亚稳态电子能级。图1-8为他们共同署名发表的论文首页以及他们的肖像。

图1-8　Lewis（a）和Kasha（b）以及二人发表的关于磷光和三线态的论文首页（c）

1948年，Th. Förster提出偶极-偶极能量转移（dipole-dipole energy transfer）的量子理论，即Förster共振能量转移理论（Förster resonance energy transfer，FRET）。这种理论后来被发展成一种依靠荧光信号变化而测试分子间距离的工具，即光谱尺（spectral rule）。

1950年，Michael Kasha（Florida State University），提出著名的荧光发射的Kasha规则。深化了对荧光产生的光物理机理的认识。

2006年，Joseph R. Lakowicz教授的《Principles of fluorescence spectroscopy》（《荧光光谱原理》）第三版出版[6]，见图1-9。从第一版到第三版内容和厚度的变化，足以反映荧光分析方法的发展趋势。荧光光谱原理三个版本的一些参数统计如下：

第一版，1983年，12章，496页（32开本），371篇参考文献；

第二版，1999年，24章，698页（大开本），2287篇参考文献，98篇延伸阅读；

第三版，2006年（原计划2010年后），26章，954页（大开本），3409篇参考文献，428篇延伸参考文献，104篇延伸阅读。

图1-9　Joseph R. Lakowicz教授（a）及其不同版本的《Principles of fluorescence spectroscopy》（b）

当然，由厦门大学完成的《荧光分析法》（科学出版社，第1～3版）对国内分析化学的发展起到了相当重要的作用[7]。

2008年，日本科学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁·查尔菲（Martin Chalfie）和钱永健（Roger Y. Tsien）因在发现和改造荧光蛋白等方面的突出贡献分享了该年度诺贝尔化学奖。如今，荧光蛋白作为一类重要的荧光生物探针已被广泛应用。

2014年，荧光显纳镜，即超分辨荧光显微镜的出现，突破了传统荧光显微镜的光学极限，3位科学家因此荣获该年度诺贝尔化学奖。该届获奖是基于两项独立的技术。第一项是Stefan Hell于2000年研制的受激发射亏蚀（STED）显微技术。此项技术采用了两束激光，一束负责激发荧光分子使其发光，另一束则负责抵消大部分荧光，只留下一块纳米大小体积的荧光区域。用该技术仔细扫描样本，得出的图像分辨率打破了Abbe提出的显微分辨率极限。Eric Betzig和William Moerner分别独立地进行研究，为第二种技术打下了基础，即单分子显微技术。这种方法依赖于开关单个分子荧光的可能性。科学家对同一区域进行了多次“绘图”，每次仅仅让很少量的分散分子发光。将这些图像叠加起来产生了密集的纳米尺寸超分辨率图像。

表1-1总结了20世纪初期到中期荧光和磷光的发展事件。荧光发展过程中，其他诸如荧光偏振现象、荧光相关光谱、共聚焦荧光显微技术、时间相关荧光和时间分辨荧光测量、单分子检测技术、多光子和上转换荧光、荧光量子点或其他各种类型的纳米发光材料等近现代或流行发光技术与理论的重要历史事件参见上述各文献，以及专著[6,8-10]或本书的后续各章节。

表1-1　20世纪初期到中期荧光和磷光的发展成就[1,2,8-10]