第三章　神经系统的发生及老化

第一节　神经发生的基因调控

神经系统的发育是一个多步骤、复杂的渐进过程，在许多因素的严谨调控下，分步骤、有次序地进行，该过程主要可以分为两个阶段，第一阶段为神经诱导阶段，早期胚胎的原始外胚层发育分化为神经外胚层，形成神经板样结构。 在此过程中，多潜能的原始外胚层细胞经过神经命运决定过程发育分化为神经干细胞。 随后，神经板卷曲成管状形成神经管，其中的神经干细胞保持未分化状态，并通过快速增殖不断扩大细胞数量。 当神经管中的神经干细胞扩增到一定数量后，一部分神经干细胞在外界信号的作用下分化为各种不同类型的神经细胞，包括神经元和胶质细胞，这一从神经干细胞到各种类型神经细胞的分化过程，就是神经发育的第二阶段——神经发生阶段（neurogenesis）。 之后神经细胞会在特定信号指导下迁移至它们最终所处的位置，相互之间通过正确的突触联系形成功能性的神经环路，从而构成整个中枢神经系统。 由此可见，中枢神经系统发育的调控过程是严谨而又复杂的，自神经前体细胞诱导、迁移、发育成熟，至最终形成相互联系有功能的神经系统网络，神经系统发育过程中的每一步都需要不同神经系统发育相关基因的表达，且这些神经发育重要调节基因的表达又都是在一组特定信号的精确诱导和调控下才有可能完成。 基因调控对神经发生过程至关重要，特别是不同发育分化阶段主要调控基因决定着神经干细胞向所需功能的神经细胞分化。 基因的表达受到其自身固有分子程序的调控和周围环境的影响，对神经发生的基因调控研究发现，许多神经发育相关基因如碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）基因、同源盒基因和骨形态发生蛋白（BMP）信号通路、Wnt 信号通路等均参与神经干细胞增殖、迁移和分化的复杂过程。 本节简要介绍神经系统发育相关基因和调控信号。

一、bHLH 基因

bHLH 转录因子家族因在一段近60 个氨基酸的片段内具有特征性的碱性bHLH 序列模式而得名。 它可与相应的基因片段结合，对基因的转录发挥调控作用。 该家族成员参与多种细胞和组织分化发育的调控，在神经发育过程中起重要作用。 bHLH 基因是调控神经系统发育的另一个重要的内在因素，bHLH 转录调控因子参与神经干细胞（NSC）的分化。 bHLH的高表达可促进干细胞的分化，相反低表达则抑制干细胞的分化，使干细胞处于持续的增殖状态。 激活型bHLH 调控因子（Mash1、Mathl、Ngn 和NeuroD、Hes6 等）可诱导神经元分化基因的表达，同时又可抑制胶质细胞分化基因的表达；抑制型bHLH 调控因子（Hesl、Hes5 等）是NSC 维持和增殖的必需因子，同时又能促进向胶质细胞的分化。 抑制型和激活型bHLH之间彼此相互调控，在NSC 的增殖和分化过程中发挥重要作用。

Ngn1 和Ngn2 在神经发生早期的皮质脑室区的神经上皮细胞中表达，与E12、E47 可形成二聚体，启动特异基因的表达，进而使神经干细胞向神经元的方向分化；Mash1 基因的表达也可使神经干细胞更趋向于向神经前体分化，Mash1 基因的功能与Ngns 存在互补性。 在非洲蟾的外胚层强制性表达NeuroD 或在大鼠神经嵴干细胞表达Mash1 都可出现神经细胞过早分化，提示神经细胞bHLH 蛋白可调节神经干细胞向神经元的分化。 Ngn1 在促进NSC向神经元分化的同时抑制其向胶质细胞分化，即使在有诱导向胶质细胞分化的因子存在的环境中，Ngn1 仍可抑制干细胞和皮质前体细胞向胶质细胞分化，并诱导其向神经元分化。Ngn2 和Mash1 能促进体外培养的神经前体细胞向神经元分化，而且Ngn2 诱导的神经元具有较多的突起，在细胞形态上比Mash1 诱导的神经元更成熟。 Ngn2 在神经前体细胞开始分化的早期阶段发挥调控作用，即从高增殖、多分化能力的NSC 向神经祖细胞分化这一特定阶段。 Mash1 也主要在这一阶段发挥作用。 Mash1 表达增强能启动NSC 向神经元方向的初始分化，表现出较强的成神经元作用。 Ngn2 和Mash1 在促进NSC 向神经元分化过程中功能互补，单一基因的缺失对大脑皮质发育影响不大，但双缺失可导致皮质发育不良。

Mash1 为哺乳动物早期神经分化发育的关键基因，其在哺乳动物的神经发生，即从多潜能细胞向神经祖细胞分化并产生神经元的过程中，具有非常重要的作用。 敲除这些基因会显示特定神经元亚型的缺失。 Mash1 含bHLH 结构域，能与启动子E-BOX 特异性结合，与E蛋白如E12、E47 结合启动下游基因的转录。 Id 竞争性地和E 蛋白结合从而实现对Mash1基因的负调控；Mash1 在中枢神经系统发育过程中是通过Notch 介导的一系列信号来调控转录的，它还可通过BMP、ras 基因、hedgehog 和Wnt 通路调节神经分化发育。 在神经干细胞向神经细胞及中间神经元分化过程中，Mash1 可诱导Dlx 基因，而Dlx 2 又可诱导谷氨酸脱羧酶67，从而控制γ-氨基丁酸（GABA）能神经元的分化。

特定基因对细胞谱系分化也有重要作用。 例如，Gsh1 和Gsh2 编码同源域蛋白对腹侧端脑前体细胞特异分化有重要作用。 在Hes1 单突变和Hes1/Hes5 双突变时，端脑NSC 增殖能力下降并伴有未成熟神经元分化。 与白血病抑制因子及其下游的STAT3 协同，BMP2 及其下游的Smad1 既可促进胶质性Smad1/STAT3/p300 转录复合物的形成，又可增加I-Ies5 和HLH 蛋白Id 家族的表达而干扰神经元性前神经元蛋白，如Ngn1 的生成，从而促进向星形细胞分化。 Ngn1 一方面可直接激活神经元分化基因，同时又可形成Smad1/p300 复合物，与胶质性Smad1/STAT3/p300 转录复合物竞争而抑制胶质细胞的生成。 在胚胎端脑，Mash1 和Ngns 主要促进向神经细胞分化；Mash1、Math3 和NeuroD 在中脑、后脑和视网膜也有同样作用。

Hes1 是bHLH 转录因子家族中的负调控因子，是神经元分化的抑制剂，它只在神经干细胞中表达，可抑制Mash1 的表达与活性。 研究表明，增加神经干细胞中Hes1 的表达，可抑制神经干细胞分化为神经元，而基因突变Hes1 的缺失，可见神经元的分化明显增加。 Hes1 和Hes5 均在端脑的脑室带区中表达，可维持神经前体细胞于无分化、增殖的状态，抑制神经前体细胞的分化。 若Hes1 和Hes5 同时缺失，不仅会导致NSC 增殖降低、分化提前，使得脑的大小、形状和细胞构筑严重紊乱，而且也会使周围神经系统的脑神经、脊神经和相关的神经节发育严重紊乱。 Hes1 能够通过与它的启动子结合而抑制其表达，表示负性自身调节机制可能在神经元的发育中起着负性调节Hes1 的作用。 与Hes1 和Hes5 不同，Hes6 是一个非典型的Hes 基因。 它不受Notch 信号的调控，能促进神经发生并抑制星形胶质细胞分化，而且在Ngn 和NeuroD 诱导神经元分化的过程中也起到不可或缺的作用。 在大脑新皮质发育过程中，bHLH 转录因子参与了关键事件的调节。 Id 和Hes 家族的bHLH 因子对维持大脑皮质多能祖细胞处于增殖状态非常重要。 前神经bHLH 因子（Mash1、Ngn1 和Ngn2）活性增强和Hes、Id 因子的活性相应减弱，引起皮质多能祖细胞由增殖状态向神经生成转变。 随着发育的皮质祖细胞中前神经bHLH 因子的抑制，促使星形胶质细胞的生成。 bHLH 因子Olig1 和Olig2 活性的增加和Id 活性的减弱启动了少突胶质细胞的形成。 bHLH 因子是决定神经细胞分化命运的重要功能基因之一，在神经发生和神经细胞定向分化中起着重要作用。 Ngn在端脑背部谷氨酸能神经元表达，而Mash1 在端脑腹部GABA 能神经元和胆碱能神经元内表达，暗示不同的前神经基因参与了不同神经元亚型的特化。 功能缺失研究发现了前神经bHLH 因子在端脑发育的作用。 研究发现，在敲除Mash1 的小鼠中，前神经bHLH 因子的活性减弱引起端脑腹部祖细胞的丢失，导致皮质GABA 能中间神经元的减少。 当Ngn2 和Mash1 同时缺失，这种表型加剧。 表明前神经bHLH 因子的活性是端脑祖细胞特化和神经元生成所必需的。

bHLH 因子在脊髓发育中也起着十分重要的作用。 脊髓背侧神经元产生于位于脑室带的6 群祖细胞（dp1～dp6），由背侧向腹侧依次排列，分别表达不同的bHLH 基因，其中Math1（Atoh1-mouse genome informatics）表达于dp1，Ngn1/2（Neurog1/2-mouse genome informatics）表达于dp2，Mash1（Ascl1-mouse genome informatics）表达于dp3-5，Olig3 表达于dp1-3，Ngn2表达于dp2-5，Gsh2 表达于dp3-5，Gsh1 表达于dp4-5。dp6 的特异性标记物目前尚不明确。有研究提示，Pax7/Dbx2/Mash1 可标记dp6。既往研究表明，Math1 调控脊髓背角dI1 神经元的产生，Math1 基因敲除小鼠脊髓dI1 神经元缺失，运用鸡胚电转技术过表达Math1，dI1 神经元数量增加。 Mash1 表达于产生dI3-5 的神经祖细胞群，Mash1 基因敲除，脊髓背角dI5 和大部分dI3 神经元消失；过表达Mash1 引起dI5 和dI3 增加，上述结果提示Mash1 在脊髓dI5和大部分dI3 神经元的产生中起着重要作用。 与Mash1 基因相反，Ngn2 基因敲除小鼠脊髓dI3 和dI5 神经元数量增加。 Olig3 调控A 类神经元的产生，Olig3 基因敲除小鼠脊髓背角Math1 表达减少，与此对应的是dI1 神经元减少，因此Olig3 通过调控Math1 的表达进而控制dI1 神经元的产生。 Olig3 基因敲除导致dI2 和dI3 神经元消失，而表达Lbx1 的B 类神经元增加并分布在dI2 和dI3 神经元的部位。 Olig3/Lbx1 共敲除小鼠脊髓dI2 神经元出现，提示Olig3 通过抑制Lbx1 的表达而调控dI2 神经元的产生。 Olig3 调控dI3 神经元产生的机制比较复杂，鸡胚电转过表达实验结果提示Olig3 可能协同Mash1 共同调控dI3 神经元的产生。Gsh2 基因敲除引起表达于dp3 祖细胞区域的Mash1 下调，dI3 神经元减少；过表达Gsh2 和Mash1，dI3 神经元增加，Ngn1 表达下调，提示Gsh2 通过下调Ngn1 调控dI3 神经元的产生。Ptf1a 是bHLH 家族的一个分子，表达在向GABA 能神经元分化的特定祖细胞中，它可抑制Tlx3 的表达，通过调控Pax2 的表达促进神经前体细胞向dI4 和dILA 即GABA 能神经元分化，抑制其向dI5 和dILB 即谷氨酸能神经元的分化。 因此，Ptf1a 和Tlx1/3 功能相反且相互拮抗，共同作用维持兴奋性神经元与抑制性神经元数量的平衡。 另外，在胚胎发育早期，Ascl1（Mash1）与Gsh1/2 协同调控Tlx1/3 的表达，进而调控dI5 神经元使细胞向谷氨酸能神经元分化。 而在晚期，dILA 及dILB 来自同一祖细胞群，Ascl1 一方面以细胞自主性方式（cell autonomous）通过调控Ptf1a，抑制Tlx1/3 和Lmx1b 的表达，使祖细胞向dILA 即抑制性神经元方向分化；同时为保证兴奋和抑制的平衡，Ascl1 以细胞非自主性方式（non-cell autonomous），调节Notch 信号，使祖细胞向dILB 即兴奋性神经元方向分化。

bHLH 蛋白家族成员数目庞大、功能繁多，各个成员在神经发生中发挥重要作用。 不同类型的bHLH 因子彼此交叉调控，协调于神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞命运的选择。最初，Hes 占主导，皮质祖细胞增殖，随着前神经bHLH 的活性增加和Hes 的活性减弱，启动了神经元的生成，而相反则引起少突胶质细胞的生成。 通过一个相互拮抗的方式，Olig 和Id活性的平衡可能调节了少突胶质细胞的分化时间。 下一步的研究方向将是进一步明确在发育中bHLH 因子平衡转变的细胞机制，以及这种平衡转变是受内部因子还是外部因子调节。

二、同源盒基因家族

同源盒（homeobox，Hox）基因家族在进化上高度保守，均含有一段183kb 的DNA 片段，编码由61 个氨基酸组成的同源结构域（homeodomain，HD）。 同源盒基因表达蛋白中同源结构域的氨基酸顺序在进化上具有极强的保守性，所具有的DNA 结合特性是各种真核生物同源盒基因表达蛋白作为转录调控因子可调节相应基因转录的基础；而特定结构域主要决定了同源盒基因表达蛋白与DNA 结合的特异性，其氨基酸顺序在进化上也具有一定的保守性，在各种真核生物的同源盒基因表达蛋白中主要起调节基因转录特异性的作用。 Hox 基因家族编码的同源结构域能特异地结合并调控靶基因，以其时空共限性调节胚胎发育及细胞增殖分化，其中的多个亚家族之间相互作用和影响，激活基因转录过程，共同实现对基因表达的调控，在神经系统分化发育、功能维持及再生中起着重要作用。

近年来，大量研究表明，在神经系统的发育过程中，作为重要的转录调控因子，同源盒基因在神经系统的早期发育分化，特别是在决定神经纵轴的前后差异，以及个别神经组织的特异化方面起关键性作用。 多种同源盒基因家族参与了包括神经细胞分化类型即细胞命运的决定、神经细胞分化的时间控制以及神经细胞的空间控制和格局化等模式建立的多个发育过程。 因此，同源盒基因家族对神经系统发育和分化的作用越来越引起人们的重视。 迄今为止，人们已发现了300 多个同源盒基因，广泛分布于从酵母到人类的各种真核生物中。 根据染色体分布、序列的同源性及表达蛋白结构的不同，将其分为两类：①Ⅰ类同源盒基因，也称Hox 基因，包括A、B、C、D 4 簇，分别串联分布于7、17、12、2 号染色体上；②Ⅱ类同源盒基因，又称non.HOX 基因，包括多个散布于不同染色体的基因家族，如LlM、PAX、EMX、POU家族等。

（一）Hox 同源盒基因

Hox 同源盒基因的表达产物是与神经系统格局化密切相关的一类重要转录调节因子，它们在建立并保持不同神经节及其神经内发育的不同类型神经元的位置特征方面均起着决定作用。 同源异形基因复合体（HOM-C）参与控制果蝇胚胎发育的分布和分节特征，Hox 基因是脊椎动物中与HOM-C 基因高度同源的基因，它们表达的最初部分是发育的神经系统，通过与果蝇HOM-C 复合体中相对应基因相似性的比较，Hox 基因在中枢神经系统的有效表达模式提示Hox 基因可能是脊椎动物神经系统产生和分布及分节特征的主控基因。

脊椎动物Hox 同源盒基因复合物是4 种从同一祖先进化而来的Hox 基因簇，分布在4个不同的染色体上，分别是Hox-a、Hox-b、Hox-c 和Hox-d，每个基因簇上的基因在结构和组成上都与其他基因簇上相对应的成员密切相关，这些相关基因被称为共生同源基因。 脊椎动物和果蝇Hox/HOM-C 基因簇包含了13 个共同的同源基因组，其中的1 ～4 个在脊椎动物后脑和腮弓表达，5～13 在脊髓表达。 研究发现，小鼠Hox 基因簇的基因在胚胎神经上皮内的表达是彼此重叠的，每个表达带的前端界限都十分明确，在后脑中，Hox 基因的表达界限与菱形节的界限也是一致的。 果蝇HOM-C 复合体中，不同同源盒基因的功能是为沿纵轴分布的不同节段建立不同的位置特征，其中某基因发挥作用的节段与它在HOM-C 基因簇上的位置有关，位于3′末端的基因影响靠前面的节段，位于5′末端的基因影响靠后面的节段，这种在染色体上的位置与表达域之间的相关性在进化上相当保守，小鼠Hox 基因簇上不同基因在染色体上的排列次序与它们每个最接近的果蝇HOM-C 基因簇上的同源物的相对排列次序是完全对应的，而且小鼠位于3′末端的基因表达也比那些位于5′末端的更靠前面。 这种在序列、染色体定位以及表达前界方面的平行保守性强烈提示，Hox 基因簇在特化脊椎动物后脑的位置特征性（至少是沿纵轴）方面起重要作用。 在胚胎发育过程中，Hoxa-2 和Hoxb-2 在前后轴作用的基础上，能以背腹轴的作用方式来决定神经元的命运趋向性和在后脑的位置。 Hoxa-2 的失活影响菱脑原节r2/r3 背侧的发育，而Hoxb-2 基因突变对菱脑原节r4 的腹部发育起重要作用。 Hox 基因的表达与中枢神经在发育中的分区有关，为不同神经元的发育提供位置特征。

Hox 基因簇中的基因仅有少部分在后脑表达，其余大部分都在脊髓表达，在脊髓有一个明显的前端界限。 发育晚期Hox 基因在脊髓表达中的作用可根据神经发生过程的表达模式来进行时间分析，中枢神经系统不同种类的神经元在不同的发育阶段和CNS 不同的背腹区域产生。 分析在神经发生的过程中横切面的Hox 基因表达发现，Hox 的表达处于动态变化中，并与神经元成熟的步骤平行。 Hox-b 基因簇所有成员的表达模式完全一致，而且随后在运动神经元中表达下调，连合神经元中表达上调，然后它们局限在背部感觉神经元表达。 这些表达模式提示Hox 基因为出生的神经元提供位置特征。 其他Hox 基因复合体的基因表达表现为不同的背腹限制性区域，提示不同的Hox 基因簇可能对不同的分析模式起作用。

（二）Pax 基因家族结构

Pax（paired box）基因是一类非常保守的转录因子，参与细胞内信号传导的高级调控，它的早期表达与神经发育过程中空间和时间的局限性有密切关系。 这类因子广泛存在于动物体内，脊椎动物共包含9 个成员（Pax1 ～Pax9），通常包括配对（paired domain，PD）、八肽域（octapeptide，OP）、同源域（homeodomain，HD）3 个保守结构域。 根据结构域组成的差异将其分为4 个亚家族：①Pax1 和Pax9，由PD 和OP 组成，不含HD；②Pax2、Pax5 和Pax8，由PD、OP 以及不完整的HD 构成；③Pax3 和Pax7，由PD、OP 和HD 组成；④Pax4 和Pax6，由PD 和HD 组成，不含OP。 Pax 蛋白中的PD 由128 个氨基酸残基组成，其编码序列十分保守，是Pax 蛋白与DNA 结合的主要功能域；OP 由24 个氨基酸残基组成，多行使转录抑制调节作用。 Pax 同源盒基因配对盒的384bp 共有DNA 序列最早是从果蝇的配对基因和两种节段极性基因gooseberry-proxial 和gooseberry-distal（Gsb-p、gsb-d）中发现的。 这3 种基因还包含另一个与同源盒相关的高度保守序列，称为配对形式同源盒。 随后在果蝇中又发现两种含有配对盒的基因Pox-neuro 和Pox-meso，它们不包含有配对形式同源盒，在小鼠、海龟、线虫、人、斑马鱼、鸡和鸟的基因组中也相继发现含有同源盒和不含有同源盒的配对盒基因。 这些基因不仅结构相似，而且功能也相当保守，在发育过程中参与神经系统的诱导过程，以及多种形式的特化。

Pax 基因的调节功能贯穿脊椎动物生长发育全过程，同一器官或细胞系的正常生长发育，常受到2～3 个Pax 基因亚家族成员的协同调控，各成员间相互交叉作用的同时又各有侧重点。 研究表明，Pax 基因的早期表达与神经系统发育中空间和时间的局限性有密切关系，提示Pax 基因在某些诱导过程、特殊细胞的分化及神经发育过程中各种解剖界限的建立等方面有着重要作用。

运用同源筛选技术，已成功分离出9 种不同的Pax 基因（Pax1 ～Pax9）。 研究它们在发育中的表达，发现所有Pax 基因在胚胎发生的早期（交配后8 ～9.5 天）就开始表达，它们以时间和空间限制性的方式沿着头-尾轴表达，这种表达方式贯穿整个发育阶段甚至在某些情况下成年期也可观察到。 因此，Pax 基因的早期表达、在神经系统表达时间和空间的局限性，提示Pax 基因在某些诱导过程、特殊细胞形式的分化以及神经发育过程中各种解剖界限的建立等方面起着重要作用。

在神经系统，有完整配对形式同源盒的Pax 基因表达较早，并且局限于有丝分裂活跃的细胞，而其他Pax 基因似乎局限于分化细胞。 Pax3、Pax6 和Pax7 都具有同源盒，在神经系统发育时，它们的表达较早，一般在交配后8.0～8.5 天在前脑中有表达，在前端和端脑表达升高，而在发育晚期Pax3 和Pax7 在前脑的表达减少，Pax6 的表达则维持。 Pax6 基因是这个家族中最早表达的基因，且其表达贯穿于整个神经发育过程。 Pax6 的表达与多种解剖界限的建立是一致的，例如头部Pax6 基因的表达从端脑延伸到间脑，直到划分间脑和中脑区域的界限至大脑后连合。 在间脑中Pax6 的表达局限于腹部丘脑并且不侵犯背面和腹部丘脑的界限。 Pax3 和Pax7 基因的表达也不侵犯神经节的界限，仅局限在上丘脑和前顶盖。 Pax同源盒基因（Pax3、Pax6 和Pax7）在大脑的这种空间限制性的特异性高表达，提示它们可能参与大脑区域的格局化，尤其是特化纵向和横向的限制性结构域的形成，且对于维持神经系统的位置特征性是必需的。

在神经管形成过程中，Pax3、Pax6 和Pax7 在交配后8 天时的基因表达仅局限在腹侧活跃增殖的神经上皮细胞中。 在神经发育过程中，神经上皮细胞注定要迁移到中间和边缘层，并分化成神经元和胶质细胞。 Pax6 基因的表达与神经管的闭合一致，并局限在神经管的基底板和中间板；而Pax3 和Pax7 的表达却局限于神经管的背部，Pax3 基因在发育早期的神经管背部表达，随后表达在神经嵴、脊髓的背部，Pax3 基因一方面对于神经嵴细胞的适当释放、迁移和增殖以及随后发育成为不同的结构或器官是至关重要的，另一方面该基因功能的正常发挥对于组成中枢神经系统完整性先决条件的神经管适当闭合以及神经外胚层的增殖都是非常必要的。 Pax3、Pax6 和Pax7 在神经管早期的背、腹部呈现限制性的表达模式，提示它们可能参与神经管的背、腹限制性表达模式的形成和特殊细胞形式的特化，并使细胞能够沿特定的通路分化。 有研究表明，Pax2 参与了脊髓GABA 能神经元的调控，Pax2 基因敲除，脊髓背角GABA 能神经元减少，而谷氨酸能神经元的标记物未发生改变。 此外，Pax 基因在脊椎动物视觉系统的发育中也起着关键的作用，Pax6 是眼睛发育的重要调控基因。

（三）LIM 基因家族

LIM 同源盒基因家族是同源盒基因的亚家族之一，它作为一类转录调节因子，通过其LIM 结构域特异的分子内或分子间相互作用，在不同种类动物的神经系统发育中发挥了极为重要的调控作用。 目前发现，该家族中的某些基因在成年动物及神经损伤再生过程中也可能有作用。 随着对LIM 同源盒基因家族研究的不断深入，将有可能为进一步认识成年与再生的分子调控机制提供新的线索。

LIM 基因家族的结构：LIM 同源盒基因所编码的蛋白序列是由同源结构域和LIM 结构域（LIM domain）这两个主要部分所构成。 其中LIM 结构域是LIM 同源结构域蛋白的特征结构，该结构位于同源盒结构域的N-末端，由两个可同时与铁和锌结合的富含半胱氨酸和组氨酸的锌指样结构——又称LIM 基序（LIM motif）通过疏水部分相互作用串联构成，通常在一个LIM 同源结构域蛋白中存在两个LIM 结构域。 LIM 结构域是蛋白质的结合和功能调节部位，并且可介导蛋白质-蛋白质的相互作用，使得LIM-HD 可和其他多种转录调节因子结合，形成更高级有序的转录调节因子复合物，进而调控特定基因的表达并参与更加广泛的发育过程。

LIM 同源盒基因家族的成员达十多种，它们绝大多数在特定的神经元亚群中表达，参与特定神经元的发育。 在C.elegans 线虫中，Lin-11 和mec-3 基因是其感觉、运动以及中间神经元特异性终端分化所必需的，其中mec-3 基因直接调控编码β-微管蛋白的mec-7 基因和编码离子通道的mec-4 基因的表达，若基因敲除mec-3 则可导致触觉受体神经元的突变以及上述触觉受体神经元特征基因表达量的明显降低或缺失。 对果蝇LIM 同源盒基因apterous（无翅基因）的功能研究表明，该基因可在果蝇幼虫翅膀发育、肌肉发育、轴突生长和神经递质选择等多种不同发育变化中起决定作用，并可调节其翅膀中integrin 的表达，从而参与细胞黏附作用的调控。

在研究脊椎动物神经系统发育时发现，LIM 同源盒基因通过不同的时空表达模式可参与包括前脑、间脑、垂体、视网膜和脊髓等多种神经系统组织的发育分化。 例如，Lhx1 基因通常在一些与感觉功能相关的多种细胞类型中表达，并在神经诱导中起作用。 Lhx1b 在中脑多巴胺能（dopaminergic，DA）神经元、后脑5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）能神经元和脊髓后角神经元中特异表达，在维持5-HT 能神经元的分化中起着关键作用。 将Lhx2 基因敲除后发现，突变后的小鼠在E13.5 天仍未形成晶状体和视网膜，并可造成大脑皮质以及脊髓的发育畸形。 Lhx3 和Lhx4 基因在垂体形成的多极过程中，通过控制垂体腺前体——Rathke’s 囊的形成，调控脑垂体特有细胞系的增殖和分化，从而决定不同种类动物垂体器官的同一性。 Lhx3 和Lhx4 以及Islet-1 基因在脊髓运动神经元的发育中也具有极为重要的作用，上述基因在运动神经元中瞬时表达，调控脊髓运动神经元细胞分化和轴突生长的多样性。 Lhx5 基因是在前脑中表达的早期基因之一，Lhx5 在前脑的模式形成中起重要作用，Lhx5 可通过调节前体细胞的增生，控制神经细胞分化和迁移，在哺乳动物海马形成中起重要作用，小鼠Lhx5 基因功能缺陷可导致海马发育障碍，Lhx5 参与了海马发育过程中前体细胞的增殖、分化和迁移。 对Lhx6 和Lhx8 基因的研究发现，它们在胚胎小鼠前脑的特定区域中表达。 Lhx6 优先在皮质中间神经元小白蛋白（parvalbumin，PV）阴性和生长抑素（somatostatin，SST）阳性的亚群中表达，对大脑新皮质和海马中的这些神经元亚型的限定是必需的。 Lhx6 对大脑皮质γ-氨基丁酸（GABA）能中间神经元的正常切线和放射移动及在出生后动物皮质的正常分布是必需的。 Lhx9 基因是Lhx2 的相关基因，也在中枢神经系统发育中表达，且Lhx9 基因仅在大脑皮质的早期神经元中表达，而Lhx2 基因的表达则遍及皮质的整个发育时期。 Lim-1 基因在小鼠发育早期（E6.5）的原条中胚层前部有高水平的表达，发育中晚期主要在端脑侧面、后脑和脊髓后索的联络神经元等一些与感觉有关的区域表达，成鼠Lim-1 的表达主要位于大脑和中脑，小脑仅有低水平的表达，推测Lim-1 的表达产物与中胚层的分化及神经发生有着密切关系。

可见，许多LIM 同源盒基因产物在不同种类动物如线虫、节肢动物和脊椎动物中都表现出类似的调控功能。 在神经系统开始发育时，大多数LIM 同源盒基因可被激活，在神经系统发育早期的组织器官特征形成和神经元细胞分化，以及后期调控组织特异性基因的表达中均具有重要功能。

（四）POU 同源盒基因

POU 蛋白是一组DNA 特异的转录调节因子，目前的研究认为POU 同源盒基因家族在神经系统发生、发育、分化、成熟中起着至关重要的作用。 根据序列同源程序及性质将POU家族蛋白分为5 组：POU-Ⅰ、POU-Ⅱ、POU-Ⅲ、POU-Ⅳ及POU-Ⅴ。 包括Brn-1、Brn-2、Brn-3、Bin-2、Bin-3、Brn-4、Bin-5、Pit-1、Oct-1、Oct-2、Oct-3/4、Oct-5、Oct-6、Oct-7、Oct-8、Oct-9、Tst-1、Unc-86 等。 中枢神经系统某些部位只表达POU 家族蛋白中之一种，而有些部位则是多种蛋白同时表达。 特定部位不同细胞表达的POU 蛋白也不完全相同，如小脑Purkinje 细胞表达Brn-1 和Bin-2，而颗粒细胞则表达Tst-1、Oct-1 及Oct-2。POU 蛋白在脑组织分布极广，其表达表现为复杂的时间性，哺乳类动物POU 蛋白不仅在发育中的神经管表达，而且也出现在发育成熟的前脑和中脑。 这些蛋白质对脑组织相应的神经细胞表型的确立起着重要的作用。

Oct-6 在发育和成年脑的特定神经元表达。 大鼠中Oct-6 的同源基因SCIP tst-1 在出生后外周神经系统发育的施万细胞中表达，而且SCIP tst-1/Oct-6 只在施万细胞分化的髓鞘生成前和髓鞘生成细胞快速分裂的时期短暂高度表达，提示该基因可能在这些细胞的程序性定向（progressive determination）过程中起重要作用。 其他POU 基因也在大、小鼠的神经系统发育中以不同的时间和空间模式表达。 Oct-1、Oct-2、Brn-1、Brn-2、Brn-3 和Pit-1/GHF-1 均在神经管表达，而且在神经系统发育晚期存在各种不同的模式表达。

Brn-3 属POU-Ⅳ，Brn-3a、Brn-3b 与Brn-3c 主要在神经细胞中表达。 Brn-3a 能激活各种类型细胞转染中的启动子，而Bm-3b 的作用恰好相反，可阻止启动子的激活。 Brn-3c 则只能激活细胞转染成为神经细胞中的启动子。 在三叉神经节神经元中有神经营养素受体酪氨酸激酶（Trk）的表达，Trk 包括TrkA、TrkB 及TrkC。 Brn-3a 通过影响这3 种Trk 受体的表达来调节三叉神经神经元的存活与分化。 如Bm-3a 缺失，则很少的神经元有TrkC 的表达。 线虫的unc-86 基因在感觉神经节细胞中表达，主要参与决定包括感觉神经元在内的神经元表型的发育。 大鼠的Brn-3 基因是线虫unc-86 基因的高度同源基因，也在感觉神经节细胞中表达，而且表达模式以及基因表达产物的蛋白质序列均与unc-86 十分相似。 Brn-3a 基因在外周感觉神经元和尾部中枢神经系统的特殊中间神经元中表达，该基因在感觉神经元中的表达受到其特异的上游增强子的调节，在Brn-3a 基因敲除小鼠中其增强子的活性会大大增强，提示Brn-3a 可负调控自身基因的表达。 Brn-3a 基因的ORF 和增强子的结合位点具有高度的保守性，如果这些位点发生突变，将影响Brn-3a 调控的下游基因。 上述结果提示，Bm-3a是神经发育过程中的一个关键调控因子，该基因的表达在发育中可以靠自身调节来维持一定的表达水平。 Brn-4 属POU-Ⅲ，是POU 同源盒基因家族成员之一。POU-Ⅲ蛋白（Bm-1、Bin-2、Bin-4 及Tst-1）在中枢神经系统内广泛表达，并且在视丘下部，其组成蛋白共同存在。Bin-4 是一种重要的转录因子，在中枢神经系统神经管发育时开始在脑内广泛表达，随后局限于成年大鼠前脑中的部分区域，如下丘脑视上核及视旁核。 近期研究显示，Bin-4 参与决定神经干细胞的分化。 有研究发现，当神经前体细胞暴露于胰岛素样生长因子-1 后，POU同源基因家族的Brn-4mRNA 和其蛋白水平出现明显上调，Bin-4 蛋白在新一代神经元得到表达。 当Bin-4 表达水平上调时，神经前体细胞分化为成熟神经元的比率将上升，用反义寡核苷酸阻止其表达时，神经前体细胞转化为成熟神经元的比率将下降，可使其停留于前体细胞阶段。 这表明Bin-4 在神经前体细胞的分化中占有重要地位。 这一现象表明细胞因子将通过影响细胞内基因表达来诱导神经干细胞定向分化。 Brn-5 在发育的中枢神经系统中、有丝分裂后期的神经元上有表达，而增殖的神经祖细胞中不表达。 Brn-5 的表达是神经元分化末期过程的早期表现，它可能作为一种转录调节因子影响着中枢神经系统神经细胞表型的确立。

一些POU 基因由于不同的剪接使其表达模式的复杂性增加。 Oct-2 的各种不同剪接物在鼠神经系统的不同区域表达。 转录产物之一编码包括Oct-2POU 结构域的蛋白，称为Mini Oct-2，在发育过程中，Mini Oct-2 在嗅觉神经上皮的表达非常高，在成年大脑中，它在嗅球的僧帽细胞层表达。 嗅觉系统是哺乳动物神经系统中感觉神经元持续生长和分化的唯一区域，因此嗅觉细胞不断重新被神经支配和保持在增殖状态。

Pit-1/GHF-1 基因在神经管短暂表达，然后在垂体表达。 垂体的发育导致从一种共同的细胞世系来源的5 种不同细胞形式在精确的时间出现。 在小鼠，腺垂体分化可观察事件的前24 小时可检测到Pit-1/GHF-1 的转录产物，直到3 天后才又检测到Pit-1/GHF-1 蛋白，与启动生长激素基因和催乳素基因的表达相关，提示Pit-1/GHF-1 参与细胞命运的决定以及神经内分泌细胞分化的时间控制。

此外，Oct-1、Oct-2、Oct-4 等POU 转录调节因子不仅可以激活转录，而且还可刺激DNA的复制。 显微注射Oct-4 反义寡核苷酸到已受精的卵细胞中可明显抑制DNA 的合成并使胚胎保持在单细胞阶段。 总之，一些POU 同源盒基因表达产物在神经细胞增殖阶段呈现高表达，提示POU 同源盒基因可能参与神经元细胞增殖以及神经细胞命运的决定过程。

（五）其他同源盒基因

Dlx 同源盒基因是脊椎动物中与果蝇Distal-less（Dll）基因相关的基因，目前已发现属于Dlx 家族同源盒基因的基因有小鼠的4 种Dlx 基因。 Nkx-2 同源盒基因是小鼠中与果蝇NK-2 基因相关的基因，它包括小鼠的4 种Nkx-2 基因。 研究发现，小鼠的Dlx-1、Dlx-2 和Nkx2-1、Nkx2-2 及Nkx2-3 在发育的前脑表达。 Dlx-1 和Nkx2 同源盒基因的表达界限与划分前脑功能和解剖区域的形态学界限是一致的，提示神经管的吻侧区域可能确实是从一个分节样结构发育来的，而Dlx-1 和Nkx2 同源盒基因像Hox 基因参与后脑分节一样参与了前脑的分节和分节特征调控。 Dlx-1 和Nkx2 同源盒基因在前脑的模式形成，尤其是间脑的模式形成中起着重要作用。

Emx 同源盒基因是小鼠中与果蝇empty spiracle（ems）同源盒基因相关的基因，包括Emx-1 和Emx-2 基因。 Otx 同源盒基因是小鼠中与果蝇orthodentide（otd）同源盒基因相关的基因，包括Otx-1 和Otx-2 基因。 Emx-1、Emx-2、Otx-1 和Otx-2 基因均在E10 小鼠胚胎的发育大脑吻侧表达。 Otx-2 在端脑、间脑和中脑所有背侧和大部分腹侧区表达。 Otx-1 的表达区域与Otx-2 基本相似，但范围比Otx-2 小并包含在其中。 Emx-2 的表达区域有端脑的背侧和小部分间脑的背侧和腹侧区域。 Emx-1 的表达限制在端脑背侧的区域。 当大脑的格局化发生时，这4 种基因的表达区域是以Emx-1<Emx-2<Otx-1<Otx-2 的顺序互相包容的连续区域。推测这4 种基因可能以背侧端脑为中心，以一种各自独立的渐进性过程建立胚胎大脑不同区域的界限。 Emx-2 同源盒基因在神经系统的分化中具有一定的调控作用。 有研究发现，成年哺乳动物室周区的神经干细胞表达同源盒基因Emx2，当神经干细胞分化成神经元和胶质细胞时，Emx2 基因表达明显下调，而Emx2 表达停止后，神经干细胞对称分化为两个干细胞的频率增加，随着Emx2 表达的增加，这种对称分化能力逐渐降低。

在神经系统的发育中，多种同源结构域蛋白家族参与了神经元细胞类型即细胞命运的确定、神经元细胞分化时间的控制以及神经元细胞分化的格局化和空间控制等过程。 研究同源盒基因家族与神经系统发育的关系，有利于预防神经系统异常分化发育和疾病的发生，为探索治疗相关疾病提供新途径。 神经系统发育分化的基因调控是一个非常复杂、精密的网络系统，同源盒基因调控信号与周围环境如何相互作用、具体的调控途径如何、各种同源盒基因之间的相互影响以及如何最终精确调控神经系统的发育分化等问题，目前仍有待于进一步深入研究。 但我们可以清楚地认识到，随着对神经系统发育分化调控因素认识的加深和新的细胞因子、化学信号的不断发现，必将为其临床应用提供广阔的前景。

三、BMP 信号通路

BMP 是一类转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）超家族蛋白，TGF-β 超家族包括近30 种与生长和分化相关的分子成员，主要由BMP、活化素（activin）和TGF-β 三个亚家族组成。 该家族蛋白在一级结构上具有某些共同特点，即蛋白质C 端含有25%相同的氨基酸残基，其中有7 个是半胱氨酸，且位置上具有绝对的保守性。 该家族成员在三胚层命运决定、以后的各组织器官发育形成以及癌症发生过程中均发挥关键的调控作用。 作为TGF-β 超家族的成员之一，BMP 最初被认为是一种具有高效骨诱导性的蛋白，能够诱导未分化的间充质细胞转化形成软骨以及骨组织，在骨及软骨的修复、成骨细胞和破骨细胞的分化增殖过程中发挥着极其重要的作用，随着研究的深入，人们对它们的生物活性及细胞外的作用机制都有了深入的了解。 越来越多的研究表明，BMP 信号通路在中枢神经系统发育的各不同阶段也起着关键的调控作用，在神经诱导和神经发生两个重要阶段均发挥重要作用。BMP 不仅和早期神经与非神经命运决定直接相关，在神经干细胞的增殖、分化以及神经系统各亚型细胞的形成过程中，BMP 也与其他信号通路如Wnt、Shh 等一起协同发挥作用。

BMP 在信号转导的过程中还牵连到Ⅰ型和Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体，这两种受体拥有众多的成员。 Ⅰ型受体有BMPR-IA、BMPR-IB、ActR-I、ALK（activin receptor-like kinase）1/2/3/6/8。BMPRI 是细胞质中的特殊的分子，其有助于增加碱性磷酸酶活性，蛋白多糖的合成，胶原蛋白的合成。 BMPRI 存在两种特殊的形态，ⅠA（ALK3、BRK1）和ⅠB（TSK7L/ALK2、BRKII、RPK1）。 Ⅱ型受体有BMPRII、ActR-II、ActR-IIB。 BMP 蛋白作为配体首先与其具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的Ⅱ型受体（BMPRII 和ActR-IIB）结合，再招募Ⅰ型受体（ALK3/BMPRIA、ALK6/BMPRIB 和ALK2/ActRI）并使之磷酸化。 磷酸化的BMPRI 也具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，然后再招募效应分子Smad1/5/8（R-Smad），并使R-Smad C 末端磷酸化。 磷酸化的R-Smad 与Smad4 结合并转运至核内，在其他转录因子的协同作用下，形成转录复合物结合至靶基因的调控区域，从而调控靶基因的表达以发挥生物学效应。 胞外生长因子BMP2、BMP4 和BMP7 的存在下容易与BMPRII 形成二聚体，使得BMPRII 受体磷酸化。 磷酸化的BMPRII 接着磷酸化Ⅰ型受体的GS 区，Smad 蛋白进入核内与核内的一些转录因子相互作用。 BMP 配体可以独立地结合到Ⅰ型或者是Ⅱ型受体亚基，但是要求这两种受体亚基有高的结合亲和力和信号活性，有活性的Ⅰ型BMP 受体可与Smad1 或Smad5 结合，并磷酸化Smad1 或Smad5 蛋白质羧基端的丝氨酸，激活的Smad1 或Smad5 蛋白可由细胞浆转入细胞核，或直接作用于下游靶基因，或与其他转录调节因子一起作用于下游靶基因。 这些BMP 特殊的Smad 和co-SMAD 会与Smad4 一起形成复合物并且进入细胞核中启动特殊基因的转录。 在细胞核中Smad1 ～Smad4 复合物结合到一些BMP 敏感基因，这些基因的启动子区域都存在GCCG 或CAGA 序列。 Smad6 和Smad7 可与ⅠB 型BMP 受体结合但不被其磷酸化，因而可抑制BMP 受体的信号传递，同时Smad6 和Smad7 还能够竞争性的结合Smad4，从而阻断其与其他磷酸化的Smad 结合，进而阻断Smad4 复合物将信号传入核内。 另外一条通路是通过p38 MAPK（p38 mitogen activated protein kinases）来调控的。 有文献表明，当Smad 途径被阻断时，p38 MAPK 能够作为补救途径来介导BMP 通路。 BMP2/4激活TAK1（TGF-beta activated kinase-1），进而调控p38 MAPK 的活性。 BMP 信号通路本身在多个层次上受到调控，noggin、chordin、follistatin 是胞外的三个拮抗因子，可与BMP 结合以抑制后者与受体相互作用，从而弱化BMP 信号的激活。

神经干细胞的增殖维持和后续的神经细胞分化是一个严谨有序的过程。 研究表明，BMP 信号通路在各个阶段都发挥重要的调控作用，并且在不同的时期、在不同的部位所起的作用不尽相同，有时甚至是相反的。 如既可以促进增殖，也可以导致有丝分裂的阻滞，这可能是由于不同时期的神经干细胞对BMP 信号的响应性差异造成的。 在中枢神经系统发育过程中，BMP 基因早期在神经板的两侧高表达，从而发挥限定神经外胚层区域的功能，当神经板闭合形成神经管后，其主要在背侧中线即顶板部位高表达。 研究表明，顶板对神经管的闭合、神经管中神经干细胞的增殖和分化的调控是十分重要的，顶板分泌的BMP 蛋白在神经管中由背侧至腹侧形成由高到低的浓度梯度，从而在上述过程中发挥关键性的调控作用。

对两栖动物神经发生的研究显示，在神经板诱导过程中，BMP4 可抑制外胚层细胞向神经元的分化，具有促进外胚层细胞向上皮细胞的分化能力。 那些可与BMP4 结合的蛋白质，如noggin、chordin 等，被称作BMP4 抑制剂，这些蛋白质可通过结合BMP4，抑制BMP4 与其受体结合，从而促进脊索附近的外胚层细胞向神经元的分化作用。 但对鸡和小鼠神经诱导研究表明，阻断BMP 信号并非是神经诱导的充分必要条件，还存在包括Wnt 等在内的许多非BMP 途径的正向神经分化诱导因素。 BMP 在哺乳动物中胚层分化、神经系统的发生中起着非常重要的作用，是神经发育所必需的，但有证据显示BMP 在不同发育阶段和不同空间位置可能具有不同的作用。 BMP 在神经板侧面的外胚层上皮细胞中的表达，可诱导神经上皮细胞分化为神经顶板，神经管背中线的顶板随后可表达多种BMP 蛋白亚型，而顶板细胞表达的这些BMP 蛋白可进一步诱导背侧脊髓中间神经元的分化。 因为BMPRIA 完全敲除会导致小鼠胚胎在原肠运动时期致死，无法进行后期神经发生过程的研究，而BMPRIB 是在E9.0 天才开始表达，所以通常都采用条件性敲除BMPRIA 来研究BMP 信号在神经发生阶段的功能。 有研究结果表明，如果通过前脑特异基因Foxg1（BF1）的启动子调控的Cre 酶，将BMPRIA 在小鼠胚胎发育早期的前脑部位条件性敲除，则会导致背侧中线发育缺陷。 也有研究表明，BMP 信号在大脑皮质神经前体细胞的形成过程中发挥正性调控作用。 而如果在小鼠胚胎中将BMPRIB 完全敲除，同时通过Brn4 启动子调控的Cre 酶将BMPRIA 在E8.5天开始条件性敲除，则导致小脑和脊髓部分发育异常。 在此BMPRIA 和BMPRIB 双敲除小鼠胚胎中，小脑明显萎缩，其中的颗粒细胞数目急剧减少；而在脊髓部位，背侧中间神经元D1 型前体细胞完全消失，随后的DI1/2 型中间神经元也无法正常发育形成。 但是在这些研究中，通过上述方法阻断BMP 信号通路后，产生的缺陷表型远不如我们所期待的那么严重，而且都是在较迟的神经前体细胞维持阶段，而对早期的神经干细胞影响不明显，这可能是由于上述对BMPRIA 的条件性敲除都是在相对较迟阶段发生，而在此之前BMP 信号通路已经发挥一定的作用，产生了一定的代偿效果。 另外通过转基因分析表明，如果利用nestin 的神经特异增强子在小鼠神经发生早期调控组成型激活BMPRIA 的表达以增强BMP 信号通路的激活，则导致神经干细胞增殖能力的加强以及数目的大幅增加。 同样在鸡胚神经发生时期，在小脑部位过表达组成型激活的BMPRIA 可以造成颗粒细胞数目的增加。

多种BMP 的成员表达于脊髓顶板，如Gdf7（dorsalin1 and growth differentiation factor 7）、BMP4、BMP6 及BMP7。运用Gdf7-DTA（diphtheria toxin，白喉毒素）小鼠，使顶板缺失，引起dp1-3 的标记物Math1、Ngn1 及Ngn2 的下调和A 类神经元（dI1～dI3）的显著减少，而B 类神经元（dI4～dI6）增加。 Dresher 小鼠因表达在顶板的Lmx1a 失活，顶板缺失，引起dI1 神经元减少；鸡胚电转过表达Lmx1a，dI1 神经元增多，dI2 ～dI6 神经元减少。 Smad 蛋白是在BMP家族成员的细胞内信号传导中起重要作用的转录因子，鸡胚电转Smad4-siRNA，也引起dp1～dp3 的标记物Math1、Ngn1 及Ngn2 的下调，A 类神经元（dI1 ～dI3）的显著减少及B 类神经元（dI4～dI6）增加。 同时，体外和体内实验均提示BMP 除调控A 类神经元细胞数量和类型，对dI1 神经元的迁移和轴突生长也发挥着重要作用。 这些研究结果都表明，在神经发育过程中，BMP 信号通路的激活对神经干细胞增殖而言是充分必要的。

BMP 信号最终都是通过调控其下游靶基因发挥作用的，研究表明，Wnt 至少部分介导了BMP 信号维持神经前体细胞增殖的作用，如通过激活BMPRIA 可以促进 Wnt-1 基因的表达；而在顶板部位通过noggin 抑制BMP 信号通路，在抑制增殖的同时可以下调Wnt 1/3 的表达，并且特异的抑制Wnt 信号通路也表现出抑制增殖的现象。 也有研究发现，作为BMP信号的响应基因，Zicl 可以通过抑制Math1 的表达从而抑制神经前细胞的终末分化。 神经干细胞多能性维持的经典机制是Notch 信号通路介导的侧面抑制模型：新生神经元表面开始表达Notch 的配体delta，从而通过细胞间相互接触激活相邻神经干细胞的Notch 信号通路，进而启动神经干细胞维持基因Hes1 的表达。 通过这种机制，新生神经元可以有效抑制相邻神经干细胞的提前分化，维持一定数量的神经干细胞。 Id 作为BMP 信号的靶分子在神经干细胞的维持过程中发挥重要作用，而其发挥作用的方式就是通过与Notch 信号下游分子Hes1 直接相互作用，从而解除Hes1 的自反馈抑制，维持Hes1 基因的高表达，从而揭示了在神经干细胞多能性维持过程中BMP 和Notch 信号的协同作用及对话机制。 此外，维A 酸可促进noggin 与BMP4 的结合，使胚胎诱导出头尾结构，并进一步参与脊髓和后脑在胚胎早期的发生；神经生长因子家族成员也可通过抑制BMP 活性（阻断BMP 基因的表达或者是干扰BMP 信号诱导系统的相互作用）诱导尾端神经板的发育。 总之，BMP 及其结合蛋白在神经板分化诱导、决定脊椎动物的中枢神经系统神经元同一性等方面均具有非常重要的作用。在背侧神经管的分化中，BMP 可诱导神经嵴细胞和背部中间神经元的发生，BMP 的表达通常是在神经管闭合后，且需要外胚层上皮细胞与被诱导细胞的直接接触，BMP 初步诱导形成的神经元还需要同源盒基因表达产物的进一步特化，才完成特定神经元的分化过程。

BMP 除了在神经发生早期促进神经干细胞的增殖，在神经发生后期也影响神经前体细胞的最终分化命运。 体外原代培养的神经前体细胞对BMP 信号还表现出年龄依赖性，这和体内各亚细胞种类的分化进程上是一致的。 如对于从E10 ～10.5 天小鼠胚胎中所分离的神经前体细胞，BMP 可以促进其凋亡，却促进妊娠中期的神经前体细胞向神经元分化，而对于妊娠后期以及成年神经前体细胞，BMP 促进其向胶质细胞的命运决定。 有研究提示，这可能是因为在不同时期由不同的BMPRI 介导了BMP 信号通路，在中枢神经发育过程中，开始只表达BMPRIA，BMPRIB 从E9.0 天才开始表达，而且其表达可能是受BMPRIA 调控的。 与上述组成型激活BMPRIA 的转基因小鼠胚胎表型不一样的是，如果在早期通过组成型激活的BMPRIB 激活BMP 信号通路，则引起神经前体细胞退出细胞周期，导致凋亡细胞增多；而在后期则促进神经前体细胞向神经元方向分化。 在中枢神经发育过程中，神经管的顶板部位始终保持较高的BMP 和Wnt 基因表达，从而形成由上至下的浓度梯度，它们对维持其中的神经干细胞的增殖和神经管的模式化都是至关重要的。 因此在神经分化过程中，BMP 和Wnt 信号的活性都必须弱化，以保证神经发生的正常进行。

虽然已经有大量的工作揭示BMP 信号通路在神经发生不同阶段的功能，并且对其作用的细胞内机制也有所研究，但是BMP 信号在神经发生过程中的功能是相当复杂的，其在神经发生不同阶段的功能差异性可能是由于调控了不同的靶基因的结果。 在神经发生的不同阶段，BMP 信号通路分别激活了哪些下游靶基因？ 哪些因素造成这种BMP 信号响应的差异性？ 这些问题的解决将有助于我们进一步认识神经发生过程的程序性，为神经系统疾病的细胞治疗提供理论基础。 作为重要分泌性因子，BMP 在中枢神经系统发育过程的各个阶段都发挥重要的调控作用，虽然我们对于BMP 信号在各个阶段的作用已有一定的认识，但基于中枢神经系统发育的阶段性和连续性，特别是神经发生过程的复杂性，我们仍需要进一步深入研究BMP 信号对各种神经前体细胞以及各种类型神经细胞的影响。 并且由于BMP 信号通路本身的复杂性，其作用的方式具有一定的环境依赖性。 因此其在神经发育各时期发挥作用的分子机制应该是特异的，而我们对于这方面的了解还远远不够。 目前，将胚胎干细胞定向分化为各种神经前体细胞和神经细胞，是神经退行性疾病治疗一个新的研究热点。由于BMP 信号在整个神经发育不同阶段都发挥作用，因此对其作用方式和机制的深入研究将有助于我们通过特异性地调控BMP 信号，把胚胎干细胞定向诱导为所需要的细胞类型，从而使得干细胞治疗成为可能。

四、Wnt 信号通路

Wnt 信号通路因其启动信号为Wnt 蛋白而得名。 Wnt 蛋白是一类从水螅到人类都广泛存在的分泌性蛋白生长因子，是一个富含半胱氨酸残基的分泌信号糖蛋白大家族，迄今为止，已在人和鼠的基因组织中至少发现19 个Wnt 蛋白家族的成员（例如Wnt-1、Wnt-2、Wnt-3 和Wnt-3a）。 它们在进化上均高度保守，长度为350～380 个氨基酸，起始为疏水信号序列，其后连接一个信号肽酶识别位点，不含跨膜结构域，带有一段由23～24 个半胱氨酸组成的几乎恒定的信号区。 Wnt 蛋白通过细胞表面受体及细胞外基质可以在较大范围内（约100μm）起到信使的作用。 目前认为Wnt 信号通路至少有4 条：①经典的Wnt/β-catenin（β-连环蛋白）信号通路（canonical Wnt/β-catenin pathway）；②Wnt/polarity 通路（或者称为平面细胞极性通路，planar cell polarity pathway）；③Wnt/Ca2+通路；④调节纺锤体定向和不对称细胞分裂的通路。 其中研究比较清楚的是经典的Wnt/β-catenin 信号通路。

Wnt 信号通路作为细胞增殖分化的关键调控环节，参与基因表达调节、细胞迁移黏附、细胞极化等一系列过程。 Wnt 蛋白通过自分泌或旁分泌作用与位于细胞膜上的受体相结合，激活细胞内信号通路，调节靶基因的表达，在胚胎的发育过程中对细胞的增殖、分化、迁移、极性化和凋亡均起到重要的作用。 在胚胎发育过程中，Wnt 途径不但参与了胚胎背腹轴的形成，而且与细胞极性建立、细胞命运决定等多个发育过程有关。 越来越多的研究证明，Wnt 信号通路在神经发生中具有非常重要的作用。

Wnt 基因在中枢神经系统中起重要调节作用，它参与控制神经干细胞的扩增及其最终分化命运的决定，并经Wnt/β-catenin 信号通路诱导神经干细胞向神经元方向分化。 对基因敲除小鼠的研究证明，Wnt 信号通路在胚胎发育过程中有重要的作用，尤其是神经系统的发育。 Wnt 基因的突变会导致中脑、海马、脊髓、神经嵴等神经组织的缺失或异常。

有研究者采用RT-PCR 的方法，从胚胎发育时期（E12.5 天）小鼠大脑半球组织中检测出有Wnt-3a、Wnt-4、Wnt-5a、Wnt-7a 和Wnt-2b 的表达，其中Wnt-1、Wnt-3a、Wnt-5a 等在神经发生中起到重要作用，这3 种蛋白都可以促进神经干细胞的增殖，其主要方式为增加S 期细胞数量、缩短G1 和（或）G2 期的时间以及抑制细胞由G1 期过渡到G0 期。 Wnt-1 通过缩短细胞分裂周期促进神经干细胞的增殖，缺少Wnt-1 将导致中脑和小脑的严重损害，而Wnt-1的过度表达则在促进神经前体细胞增殖的同时抑制其分化。 另外，在胚胎发育过程中，Wnt信号通路的动态变化控制着哺乳动物皮质中神经发生的启动。 利用BAT-GAL 小鼠发现，在皮质发育过程中，经典的Wnt 信号从新皮质侧、前区开始逐渐减弱，到出生时消失。 而新皮质中神经发生的时间和Wnt 信号的衰退有关，开始于Wnt 信号衰退的区域，并跟随着Wnt信号衰退的方向逐步扩展，形成一个神经发生的进展波。 同时，利用杂交的方法，创建持续表达Wnt 基因的小鼠，其神经源性基因Pax6、Ngn2 等显著下降，表明神经发生被破坏。 另外，有多种Wnt 参与到神经组织的发育过程中。 比如Wnt-3、Wnt-3a、Wnt-7b、Wnt-8b 参与前脑的发育，缺乏Wnt-3a 的小鼠不能扩充前体细胞，导致海马发育的异常。 Wnt-7a 直接参与突触前结构的形成。 Wnt-4 引导脊髓背侧连合神经元（commissural neurons）的轴突在穿过脊髓中线后由D-V（背-腹）方向改为A-P（头-尾）方向。 脊髓运动神经元表达Wnt-3 来引导感觉神经元与之正确连接，从而形成可控制肌肉的神经通路。 此外，Wnt 信号途径的激活可减少Notch 信号通路下游靶基因Hes-1 和Hes-5 的表达，表明在出生后的神经形成过程中，Wnt信号途径与Notch 途径协同作用增强了神经干细胞的分化。

新近的研究发现倾向于Wnt 信号通路促进神经干细胞的分化，而且大幅提高了神经元的分化比例。 Wnt-3a 虽然不能直接促进P19 细胞（多能干细胞）向神经细胞分化，但对于已经进入分化状态的P19 细胞，Wnt-3a 可以显著促进其向神经元分化。 Wnt-1 不但促进P19细胞向神经元分化，并且可以抑制神经胶质的分化。 在使用含有Wnt-3a 蛋白的条件培养液培养E11.5 天的胎鼠前脑的神经干细胞发现，神经干细胞球的增殖被抑制，神经干细胞大量分化成为神经元。 加入Wnt-3a 抗体后神经干细胞的增殖能力恢复，神经干细胞球的数量明显增加。 当条件培养液中的神经生长因子2 去除后，分化的神经元形态则更为成熟。 来源于小鼠大脑皮质的神经干细胞过表达Wnt-7a 或β-catenin，即使在培养液中加入神经生长因子2，依然大量向神经元分化，阻断Wnt 信号通路后导致神经元分化被抑制。 运用转基因小鼠进行体内实验发现稳定表达活化β-catenin 可以促进神经嵴干细胞（neural crest stem cell，NCSC）分化成为感觉神经元。 β-catenin 基因突变后，感觉神经元大量缺失。 体外培养发现Wnt-1 促使76.4%的神经嵴干细胞分化成为神经细胞，其中95.4%为感觉神经元，而且细胞的增殖不受影响。 但即使在一个区域里Wnt 信号通路对神经干细胞也可以表现出不同的作用。 对胚胎腹侧中脑神经干细胞的研究发现，同在腹侧中脑，Wnt-1、Wnt-3a 和Wnt-5a 的作用却各不相同。 Wnt-1 主要促进神经干细胞的增殖同时也有助于各类神经元的分化。 Wnt-3a 主要促进神经干细胞的增殖。 Wnt-5a 却主要促进神经干细胞向多巴胺神经元分化。

在脊髓发育中，Wnt-1 和Wnt-3a 参与神经元亚型的决定。 在脊髓背侧部分，Wnt 对于中间神经元DI、D2、D3 的发生是必需的。 Wnt1/3a 共敲除，脊髓dI1 和dI3 神经元显著减少，而dI4 和dI6 增多，Gdf7 和BMP4 的表达不变。 在Wnt 信号通路中，处于中心地位的一个组分是β-catenin，它在细胞中的数量和存在的状态，对Wnt 信号转导有决定性的影响。 同时，βcatenin 也是Wnt 信号通路中与其他分子相互作用最活跃的组分。 研究表明，β-catenin 基因敲除，Olig3 表达缺失，β-catenin 过表达，Olig3 表达增加，Foxd3（dI2）和Isl1/2（dI3）数量增加，Lbx1 表达减少；β-catenin 过表达同时Olig3 基因敲除，Foxd3 和Isl1/2 表达缺失，Lbx1 表达增加。 鸡胚电转BMP 的受体或BMP 的抑制分子，均提示BMP 和Wnt/β-catenin 是相互协调发挥作用的。 上述结果进一步证实了Wnt/β-catenin 作为BMP 的下游，通过调节Olig3，调控脊髓A 类神经元的产生。

Wnt 信号通路作为一条多环节、多作用位点的开放通路，是调控细胞生长、增殖、分化的关键途径，对神经系统而言，已有足够证据显示Wnt 信号通路参与了神经前体细胞的增殖、分化以及细胞命运的调控。 无论是在胚胎期和成年期的神经发生，还是皮质模式发生以及突触形成过程中，均有Wnt 信号通路的参与。 但是，Wnt 信号通路对神经发生的作用不能简单地加以总结，不同的条件下或许就有不同的结果，神经干细胞发育的阶段、Wnt 信号蛋白的种类、Wnt 的信号强度等因素都可能与之相关。 产生这种现象可能的机制之一是神经干细胞自身的特点及所处的微环境可能会导致细胞对Wnt 信号的不同反应，另外一个可能性是Wnt 信号通路下游的靶基因众多，不同的靶基因产生的作用不尽相同。 例如cyclin D1、cmyc 参与控制细胞周期；neurogenins、NRSF/REST 参与神经生发；ephrins 参与细胞间作用。但其根本的分子机制目前尚不清楚。 Wnt 信号通路也可能与其他信号通路“crosstalk”，通过相互协同，最终表现出对神经系统的特定效应。 然而，对于Wnt 信号通路及其相关分子如何实现对上述过程的调控，即它们对应的细胞及分子机制还不甚清楚。 所以，需要进一步研究Wnt 信号通路，确定其组分的功能，这对于有目的地干预神经发生、研究治疗神经系统疾病或损伤的靶点和药物，都有非常重要的意义。

总之，神经发生的基因调控是一个非常复杂、精密的网络系统，受到包括多种基因表达、信号转导以及周围环境等诸多因素的共同调节。 神经前体细胞处于体内复杂的环境当中，不同时间和不同空间的不同增殖或分化信号使它们具有不同的细胞命运。 神经干细胞基因调控信号与干细胞周围环境如何相互作用精确调控其增殖分化，尚有待进一步研究。 目前已经发现了许多不同种类的基因在神经系统发生中是必需的，且对这些基因的细胞位点、表型和结构均有了一些认识。 对神经发育相关基因的研究表明，几乎所有基因在神经发育中的功能都不是单一的，许多突变体在影响神经系统发育的过程中都具有多效性。 因此，对神经系统发育相关基因的时空表达模式和具体功能还需要进一步研究确定，才能为整体阐明神经系统发育的基因调控机制奠定基础。