第二章　生物标志物及药物基因组学在肺癌个体化治疗中的作用

肿瘤生物标志物（tumor biomarker）是指在恶性肿瘤发生、发展过程中，由肿瘤细胞合成、释放或由机体对肿瘤反应而产生，并能够被客观检测到的指示物。它可能是肿瘤细胞的特异性产物，也可能是存在于正常细胞中，但在恶性肿瘤组织中异常表达的产物。肿瘤生物标志物存在于细胞或组织中，也可以进入患者的血液、浆膜腔等，能够被生物化学、免疫学及分子生物学等方法测定。肿瘤生物标记物可以用来判断恶性肿瘤的存在、来源、性质，与肿瘤发生、发展密切相关，在肿瘤诊断、疗效观察、疾病复发监测以及预后评估中具有一定的价值。鉴于生物标志物在肿瘤个体化诊疗中的重要作用，其一直是肿瘤研究的热点和方向之一。

关于肺癌生物标志物的研究方兴未艾。迄今已经报道了超过100多种肺癌生物标志物，但这些生物标记物绝大多数未经过大样本、多中心的临床验证，仅有少部分生物标志物可用于肺癌的早期诊断、病理分型、预后判断和复发监测等方面［1］。近年研究表明，检测某些肺癌生物标记物的表达，能够预测化疗药物在肺癌治疗中的敏感性和毒副作用，对临床治疗方案的选择、疗效及不良反应的预测具有一定价值，对肺癌的个体化治疗具有重要的临床意义。

一、常见的预测肺癌化疗疗效的生物标志物

（一）预测铂类药物化疗疗效的生物标记物

核苷酸切除修复交叉互补基因（excision repair cross-complementation group 1，ERCC1）定位于染色体19q13.2-q13.3，包括10个外显子，编码含297个氨基酸的蛋白质，与着色性干皮病基因F（xeroderma pigmentosum pomplementary group F，XPF）形成异二聚体，是核苷酸切除修复（nucleotide-excision repair，NER）途径的限速酶，而NER途径在DNA损伤修复中发挥重要作用。顺铂为肺癌化疗中最常用的药物之一，其通过与DNA发生交联形成铂-DNA加合物，导致螺旋链断裂，破坏DNA复制过程，使细胞凋亡。ERCC1能够移除顺铂-DNA加合物，从而减弱了顺铂抗癌活性，导致顺铂抵抗。因此，ERCC1的表达预示对铂类药物敏感性的降低［2］。

1.ERCC1对可完全切除的NSCLC术后含铂化疗方案疗效的预测作用

2005年，Simon等［3］回顾性的分析了51例完全手术切除的NSCLC患者中ERCC1 mRNA表达与预后的关系。研究采用RT-PCR方法检测了NSCLC组织中ERCC1 mRNA表达水平，以18SrRNA作为内参进行标准化处理后，ERCC1mRNA表达范围为4.96~2008，中位值为54.76，根据表达值50将患者分为ERCC1低表达组和高表达组，结果提示，ERCC1高表达的NSCLC患者中位生存时间（median survival time，MST）为94.6个月，而低表达患者的MST仅为35.5个月（P=0.01）。作者认为ERCC1表达减少使得DNA修复功能下降，从而导致突变基因累积，而突变基因增多将导致肿瘤恶性程度增高和治疗后复发风险增加。另外一项前瞻性研究［4］采用RT-PCR方法检测了完全手术切除的NSCLC患者中ERCC1的表达。结果表明，对于Ⅲ期NSCLC患者来讲，ERCC1高表达组无疾病生存间期（disease-free interval，DFI）较低表达组更长（P=0.038）；ERCC1高表达的Ⅰ期肺鳞癌患者较低表达患者总生存期（overall survival，OS）更长（P=0.028）。Olaussen等［5］回顾性分析了Ⅲ期临床试验IALT（International Adjuvant Lung Cancer Trial）中部分肺癌患者ERCC1表达对含铂类辅助化疗方案疗效的预测作用，研究采用免疫组化法检测了867例完全手术切除的NSCLC患者组织中ERCC1的表达。在免疫组化结果判定中根据染色强度不同，分别将染色强度记为0、1、2、3；根据染色面积的不同，分别将0、1%~9%、10%~49%和≥50%的染色面积计为0、0.1、0.5和1.0，然后根据二者乘积的中位数1.0判断ERCC1阳性或阴性表达。结果表明，在ERCC1阴性表达的患者中，接受术后含铂方案辅助化疗的患者五年生存率（47%）较对照组（仅观察，39%）明显升高（调整后HR=0.65；95%CI：0.50~0.86；P=0.002），化疗组中位OS为56个月，而对照组仅为42个月。ERCC1阳性表达的患者无法从化疗中获益（调整后HR=1.14；95%CI：0.84~1.55；P=0.40）。然而，观察组ERCC1阳性表达患者五年生存率明显高于ERCC1阴性表达患者，分别为46%和39%（调整后HR=0.66；95%CI：0.49~0.90；P=0.009）。此研究提示在早期可完全切除的肺癌患者中检测ERCC1蛋白表达有助于筛选能从含铂化疗方案中获益的患者。2008年，Lee等［6］亦采用免疫组化法评价了130例完全切除肺癌患者中ERCC1表达与预后的关系，其结果也表明，ERCC1阳性表达患者较ERCC1阴性表达患者OS更长（7.6年vs.4.0年，P=0.046）。随后的一项研究［7］采用自动定量蛋白表达荧光染色（automated quantitative analysis，AQUA）方法回顾性分析了IALT试验数据库中ERCC1表达与铂类疗效的关系。研究结果与前述研究一致：对照组中ERCC1高表达患者较低表达患者的预后更好，但差异无统计学意义（OS：HR=0.77，P=0.10；DFS：HR=0.80，P=0.12）；研究也提示仅ERCC1低表达患者能够从含铂辅助化疗中获益（OS，HR=0.73，P=0.02；DFS，HR=0.76，P=0.04）。

以上研究提示，在早期完全切除的NSCLC患者中，ERCC1高表达患者预后更好；ERCC1低表达患者能够从含铂辅助化疗中获益。

2.ERCC1对进展期NSCLC含铂化疗方案疗效的预测作用

2002年，Lord等［8］首次回顾性分析了ERCC1预测进展期NSCLC含铂化疗方案疗效的作用。研究采用RT-PCR方法检测接受吉西他滨联合顺铂方案化疗的56例晚期NSCLC患者中ERCC1mRNA表达。该研究将mRNA表达的中位值6.7作为区分ERCC1高、低表达的截断值。结果表明，ERCC1mRNA低表达患者较高表达患者具有更长的MST（61.6周vs.20.4周），差异具有统计学意义，其缓解率也更高（52% vs.36.4%），但差异并无统计学意义（P=0.38）。2014年，一项Ⅲ期临床试验研究也采用RT-PCR方法检测了280例接受含铂化疗方案的晚期NSCLC患者中ERCC1表达与化疗疗效的关系。该研究将ERCC1mRNA表达水平以β-actin为内参进行相对定量分析，以中位值0.67区分ERCC1高、低表达。结果表明ERCC1低表达患者较高表达患者化疗缓解率更高（49% vs.34.6%，HR=1.82，95%CI：1.01~3.20，P=0.04）；ERCC1高表达患者OS较低表达患者明显缩短（16.05个月vs.21.32个月，HR=0.43，95%CI：0.27~0.89，P=0.008）［9］。随后的几项研究也表明ERCC1mRNA低表达的晚期NSCLC患者使用含铂类化疗方案疗效更好，预后更佳［10，11］。另外，Lee等［12］采用免疫组化方法检测了50例接受含铂化疗方案的晚期NSCLC患者组织中ERCC1的表达，并评价了ERCC1表达与预后的关系。研究表明：ERCC1高表达患者较低表达患者的MST更短（8个月vs.11个月）。一项回顾性研究也采用免疫组化方法检测了124例接受铂类化疗的晚期NSCLC患者中ERCC1的表达，结果表明：ERCC1低表达患者中ORR（objective response rate，客观缓解率）为54%，而高表达患者ORR仅为36%（P=0.042）；ERCC1低表达患者较高表达患者的OS显著延长（分别为13.4个月vs.9.1个月，P=0.006）［13］。

以上研究结果提示，在进展期NSCLC患者中ERCC1低表达患者对含铂化疗方案更敏感，更能从中受益，但在早期完全切除的NSCLC患者中，ERCC1高表达患者预后更好。其原因可能是早期手术切除的肿瘤中ERCC1高表达患者DNA损伤较少，肿瘤细胞具有更多的惰性行为。因而与正常细胞更接近，难以从化疗中获益，预后更好，但在晚期肺癌中，ERCC1低表达的患者对含铂化疗方案更加敏感，更能从中获益［2］。

虽然许多研究表明，NSCLC患者中ERCC1的表达与铂类药物化疗敏感性及预后相关，但是也有一些研究并未得出相似的结论。Booton等［14］进行的一项前瞻性的Ⅲ期临床试验采用RT-PCR方法检测了66例接受含铂方案化疗的晚期NSCLC患者ERCC1 mRNA的表达。结果表明：ERCC1 mRNA表达与化疗疗效无明显相关（P=0.794）；ERCC1 mRNA高表达患者与低表达患者的MST无明显差异（415天vs.327天，P=0.801）。

基于以上研究，一项meta分析系统评价了进展期NSCLC患者中ERCC1表达与铂类药物化疗敏感性及预后的相关性。该研究共纳入了11篇相关文献，共1219例患者，9篇文献评价了ERCC1与化疗敏感性的关系，8篇文献评价了ERCC1表达与OS关系；6篇文献采用免疫组化方法检测ERCC1蛋白表达，5篇文献采用RT-PCR方法检测ERCC1mRNA表达。结果表明：ERCC1高表达的晚期NSCLC患者对铂类药物化疗敏感性较低表达患者下降20%（RR：0.80，95%CI：0.66~0.98），并且死亡风险明显升高（HR=2.03，95%CI：1.49~2.78）。亚组分析表明，在RT-PCR检测亚组中，ERCC1高表达患者死亡风险是低表达患者的3.02倍（HR=3.02，95%CI：1.96~4.63），而且RT-PCR组异质性较小（I2：0，P=0.55），但在是免疫组化检测亚组中ERCC1高表达患者死亡风险是低表达患者的1.63倍（HR=1.63，95%CI：1.20~2.21），异质性较大（I2：59%，P=0.04）。RT-PCR组和免疫组化组间也具有较大异质性（I2：90.7%，P=0.001）。研究者认为，虽然研究结果支持检测NSCLC患者中ERCC1表达有助于预测铂类药物化疗敏感性及患者预后，但是免疫组化和RT-PCR这两种不同的检测方法之间存在一定差异，即使在免疫组化组内也存在很大差异，这就势必影响到结论的可靠性。因此，今后尚需开展设计更加合理、方法更加标准化的研究，以明确ERCC1预测铂类疗效的准确性［15］。

总体而言，大多数研究结果仍旧表明，在早期完全切除的、未接受放化疗的NSCLC患者中，ERCC1高表达提示预后良好，而在进展期NSCLC中，ERCC1高表达则提示对铂类药物抵抗，而低表达则提示对铂类药物敏感。

（二）同时预测铂类和抗微管类药物化疗疗效的生物标志物

BRCA1（breast cancer susceptibility gene1）基因是肿瘤抑制基因，定位于染色体17q21，含有23个外显子，已经被公认为乳腺癌和卵巢癌的易感基因。BRCA1突变增加了乳腺癌和卵巢癌的发病风险。该基因编码的蛋白是核磷蛋白错配修复通路中的一员，具有多种生物学功能，不仅参与DNA错配修复，而且在纺锤体组装及细胞凋亡过程中发挥重要作用。目前，已有多数研究表明BRCA1基因表达可能与铂类、紫杉类等抗微管类化疗药物的敏感性有关。在NSCLC患者中，也有大量关于检测BRCA1基因预测铂类和抗微管类化疗药物敏感性的报道［9，16］。

1.BRCA1对可切除的肺癌化疗疗效的预测作用

Taron等［17］在一项前瞻性研究中采用RT-PCR法检测了55例接受新辅助化疗后手术切除的NSCLC组织中BRCA1mRNA表达，采取四分位法将不同BRCA1表达的患者分为四组。研究表明，BRCA1mRNA表达<0.61组的患者预后最好，MST最长（在试验未结束时OS已得出阳性结果），而表达>2.45组的患者预后最差。BRCA1 mRNA表达介于0.65~1.20和1.23~2.37组患者的MST达37.8个月（95%CI：10.6~65.0），而表达>2.45的患者其MST仅为12.7个月（95% CI：0.28~28.8，P=0.01），提示BRCA1 mRNA低表达的NSCLC患者更能从含铂化疗方案中受益。Pesta等［4］的一项前瞻性研究采用RT-PCR方法检测59例接受术后辅助化疗的NSCLC患者的BRCA1表达及其与预后的关系。该研究通过将BRCA1mRNA表达与管家基因GAPDH表达的比值进行标准化处理，取其中位数区分BRCA1高、低表达。结果表明，Ⅰ期肺鳞癌患者中BRCA1 mRNA高表达者其OS更长（P=0.033）。Pierceall等［18］采用免疫组化回顾性地分析了395例手术后接受含铂方案化疗的Ⅰ~Ⅲ期NSCLC患者中BRCA1表达，结果并未发现BRCA1表达与无病生存时间（disease free survival，DFS）和OS相关。

总之，在完全切除的NSCLC患者中，BRCA1基因表达对化疗预测作用的研究结果迥异，既有研究认为BRCA1低表达的患者能从化疗中受益，也有研究得出了BRCA1高表达患者的OS更长的结果。鉴于目前关于BRCA1在完全切除NSCLC中化疗预测作用的研究较少，样本量都比较小，因此，尚需进一步扩大样本量进行多中心RCT研究。

2.BRCA1对进展期NSCLC化疗疗效的预测作用

在晚期NSCLC中，应用BRCA1预测化疗疗效的研究也有报道。Boukovinas等［19］进行的一项回顾性随机对照研究纳入了102例晚期NSCLC患者，采用RT-PCR检测BRCA1 mRNA表达，并采取三分位法区分BRCA1表达，将表达量由低到高分别记为T1、T2和T3。结果表明，在接受多西他赛联合吉西他滨一线化疗的晚期NSCLC患者中，BRCA1 T3表达的患者ORR为53.1%，而BRCA1 T1和T2表达患者ORR分别为25.8%和12.5%（P=0.002），BRCA1 T1、T2和T3表达的患者无进展生存期（progression-free survival，PFS）分别为3个月、3.6个月和5.5个月（P=0.25）。但是在接受含铂的二线化疗方案的31例患者中BRCA1 T1、T2和T3三组的至疾病进展时间（time to progression，TTP）分别为6.6个月、2个月和2.4个月（P=0.004），该研究提示BRCA1高表达的患者对紫杉类化疗药物敏感而对于铂类药物不敏感。Wang等［20］采用RT-PCR法检测20例晚期NSCLC恶性胸腔积液中BRCA1mRNA表达与顺铂和多西他赛敏感性的关系，结果表明，BRCA1表达与顺铂敏感性呈负相关（P=0.001，r=0.685），而与多西他赛敏感性呈正相关（P=0.008，r=-0.573）。Zhang等［21］采用免疫组化法回顾性的分析了136例接受吉西他滨联合顺铂、紫杉醇联合顺铂或卡铂和长春瑞滨联合顺铂或卡铂方案化疗的晚期NSCLC患者中BRCA1的表达。免疫组化结果评定标准为：不表达或阳性细胞数<5%为阴性表达；阳性细胞数≥5%为阳性表达。BRCA1阴性表达患者与阳性表达患者化疗后ORR分别为48.5%和37.1%（P>0.05）；BRCA1阴性表达患者MST及PFS均较阳性表达者延长（MST：16个月vs.9个月，P<0.05；PFS：7个月vs.6个月，P<0.05）。以上研究提示，BRCA1的表达与紫杉类药物敏感性呈正相关，但与铂类药物敏感性呈负相关。

但是，关于BRCA1能否预测化疗疗效的研究也有不一致的结果。西班牙Moran［22］主持的一项随机Ⅲ期临床研究纳入了SLCG（Spanish Lung Cancer Group）和中国的部分晚期NSCLC患者，检测BRCA1和RAP80（receptor-associated protein 80，参与BRCA1的基因修复功能）mRNA的表达与化疗敏感性的关系。此研究根据三分位法将肺癌患者中二者的表达分为低、中、高三组：RAP80低表达（组1）接受吉西他滨加顺铂化疗，RAP80中、高表达和BRCA1低、中表达（组2）接受多西他赛联合顺铂化疗，RAP80中、高表达和BRCA1高表达患者（组3）接受多西他赛单药化疗，对照组均接受多西他赛联合顺铂治疗。研究表明，279例SLCG组患者中对照组PFS为5.49个月，而试验组为4.38个月（P=0.07；调整后HR=1.35，P=0.03），组1、组2和组3患者PFS分别是5.43个月、5.49个月、2.50个月（P=0.003）。在124例中国患者中，对照组PFS为4.74个月，试验组为3.78个月（P=0.82），组1、组2和组3患者PFS分别是5.59、3.78和2.73个月（P=0.55）。根据既往文献报道，BRCA1高表达者对紫杉类药物敏感，研究者预期组3患者能够从多西他赛单药化疗中受益，但是试验结果与预期相反，分析其原因可能是由于试验组采用单药化疗而对照组为两药联合化疗所致。另外一项前瞻性研究也采用免疫组化方法检测了537例NSCLC患者（包括大部分晚期患者）中的BRCA1的表达，但是没有发现BRCA1表达与疾病控制率（disease control rate，DCR）、PFS或OS有相关性［23］。

鉴于以上研究结果的差异，2013年的一项meta分析［24］共纳入了16篇文献、共1330例患者，评价了进展期肺癌中BRCA1表达预测含铂类药物化疗的有效性，并纳入3篇文献评价了BRCA1表达与紫杉类药物化疗有效性的关系。结果表明BRCA1阴性或低表达患者较阳性或高表达患者ORR更高（48.9% vs.38.1%，OR=1.70，95%CI：1.32~2.18，I2=44.7%，P=0.03）、OS更长（HR=1.58，95%CI：1.27~1.97，I2=48.4%，P=0.03），亚组分析结果表明：12篇文献、共1066例患者，采用免疫组化方法检测了BRCA1表达，而4篇文献共264例患者采用RT-PCR方法检测BRCA1表达，2个亚组均发现BRCA1表达与ORR有关。在接受含紫杉类药物化疗的患者中，BRCA1阳性或高表达患者较阴性或低表达患者ORR更高（26.0%vs.46.1%，OR=0.41，95%CI：0.27~0.64，I2=0.0%，P=0.61）。以上结果表明，在BRCA1低表达的患者选择铂类为基础的化疗方案可能更好，而BRCA1高表达的患者最好选择紫杉类为基础的化疗方案，但是研究中存在一定的异质性，因此对结果的可靠性造成了一定的影响。此外，最近的Moran［22］的这项较大样本量的研究不支持此结论。因此，关于BRCA1预测化疗有效性的研究尚需要大样本、多中心的研究和更加严格的设计方案去进一步探讨，以期得出更加准确、一致的结论。

（三）预测吉西他滨化疗疗效的生物标志物

核糖核苷酸还原酶M1（ribonucleotide reductase M subunit 1，RRM1）基因位于11p15.4，是唯一能够催化核糖核苷酸转化为脱氧核糖核苷酸的酶，而脱氧核糖核苷酸是DNA合成和修复所必需的。因此，RRM1在DNA复制和修复过程起到重要作用。吉西他滨是核苷酸类似物，也是RRM1作用靶点，能够抑制核苷酸还原酶活性，降低了脱氧核苷酸的生成，从而影响DNA合成和修复，因此，RRM1表达水平可能与吉西他滨的疗效有关，目前已经有众多关于RRM1预测吉西他滨疗效的研究［2］。

1.RRM1对可切除的肺癌化疗疗效的预测作用

在一项回顾性研究中，Zheng等［25］采用AQUA方法检测了187例完全手术切除、未接受辅助放、化疗的NSCLC患者中RRM1蛋白的表达，采用AQUA中位值40.5区分RRM1高、低表达。结果表明：RRM1高表达的患者较低表达患者具有更长的OS，分别为120个月和60.2个月（HR=0.61；P=0.02），RRM1高表达患者比低表达患者的无病生存期（disease free survival，DFS）也更长（120个月vs.54.5个月，HR=0.46，P=0.004）。在另外一项回顾性的研究中，Pesta等［4］采用RT-PCR方法评价了56例手术后接受长春瑞滨联合顺铂或紫杉醇联合卡铂方案化疗的Ⅰ~Ⅲ期的NSCLC患者中RRM1mRNA表达与化疗疗效和预后的关系，在肺腺癌中RRM1高表达患者较低表达患者OS更长（803天vs.386天，P=0.002）；Ⅲ期NSCLC中RRM1高表达的患者较低表达者DFS更长（643天vs.144天，P=0.004）；在Ⅲ期鳞癌中，RRM1高表达的患者较低表达患者具有更长的OS（P=0.044）。但是也有研究得出了不一致的结论，例如Tantraworasin等［26］采用免疫组化方法检测了247例手术切除的Ⅱ~Ⅲ期NSCLC患者中RRM1的表达，免疫组化评价标准为：0表示无染色，+表示1%~10%染色，++表示11%~50%染色，+++表示≥50%染色；++和+++代表高表达。0和+代表低表达。结果表明，无论是否接受辅助化疗，受试者中RRM1的表达均无法预测肿瘤复发和OS长短，在接受吉西他滨化疗的NSCLC患者中RRM1也未显示出预测作用。

以上研究表明，在可完全切除肺癌患者中，RRM1高表达提示预后良好，该结果与ERCC1在可切除肺癌中的预测作用的研究结果类似，但是该结果尚需进一步研究证实。

2.RRM1对进展期肺癌化疗疗效的预测作用

Rosell等［27］回顾性的采用RT-PCR方法检测了100例晚期NSCLC患者组织中RRM1 mRNA表达，研究表明在接受吉西他滨联合顺铂化疗的晚期NSCLC中RRM1mRNA低表达的患者比高表达的患者具有更长的中位生存期，分别为13.7个月和3.6个月（95%CI：9.6~17.8，P=0.009）。随后的两项临床试验［28，29］分别研究了晚期NSCLC患者中RRM1的表达与吉西他滨联合卡铂和吉西他滨联合培美曲塞化疗疗效的关系，其结果也与前期结果类似，这两项研究都提示RRM1表达与吉西他滨疗效呈负相关。在另外一项回顾性研究中，Lee等［30］采用免疫组化法检测了40例接受吉西他滨化疗的晚期NSCLC患者中RRM1的表达和预后的关系，免疫组化结果评定标准：染色面积≥50%记为3；10%~49%记为2；1%~9%记为1；无染色记为0，而且染色强度也分0~3，无染色为0；弱染色1；中等染色2；强染色3。二者乘积>9表示表达阳性，<9表达阴性。研究表明，RRM1阳性表达的患者OS明显短于RRM1阴性表达的患者，分别为5.1个月和12.9个月（P=0.022）。同样，RRM1阳性表达者DCR也明显低于阴性表达者（23%vs.56%，P=0.053）。一项针对RRM1表达的系统评价结果表明，在纳入的12项研究共593例患者中，低表达患者的ORR（OR 0.35，95%CI 0.24~0.51）及生存率（OR 0.41，95%CI 0.23~0.71）均优于高表达患者［31］。但Bepler等［32］进行的一项RCT研究则得出了相反的结果，该研究根据ERCC1和RRM1表达的不同，采用AQUA方法将331例晚期肺癌患者分为RRM1低/ERCC1低、RRM1高/ERCC1低，RRM1低/ERCC1高、RRM1高/ERCC1高四组，分别给予吉西他滨联合卡铂、多西他赛联合卡铂、吉西他滨联合多西他赛、多西他赛联合长春瑞滨方案化疗，而对照组（未选择的患者）则均采用吉西他滨联合卡铂化疗。研究发现，对照组的疗效优于ERCC1低/RRM1低表达试验组，其PFS分别为8.1个月和5.0个月，与预期相反。研究者考虑是由于在试验设计上该试验组与对照组内的RRM1低/ERCC1低表达的患者均接受了吉西他滨联合卡铂方案化疗，这样就形成了内部对照组，从而产生了假阴性结果，导致两组间的PFS（6.1个月vs.6.9个月）和OS（11.0个月vs.11.3个月）无显著性差异。

鉴于各项研究间结果的差异，2012年报道的一项meta分析［33］纳入了18篇相关文献共1243例患者，系统评价了晚期NSCLC中RRM1表达与ORR和预后的关系，其中13篇文献报道了RRM1表达与ORR的关系，15篇文献报道了RRM1表达与MST的关系，8篇文献采用RT-PCR方法，10篇文献采用免疫组化方法检测RRM1表达。研究表明，RRM1低表达/阴性表达的患者能从含吉西他滨的化疗中受益，低表达/阴性表达患者较高表达/阳性表达者的ORR更高（分别为44.9%和22.2%，HR=0.31，95%CI：0.21~0.45，P<0.00001；P=0.11，I2=34.1%）。亚组分析表明，免疫组化组RRM1低表达/阴性表达组和高表达/阳性表达组缓解率分别是41.7%和16.1%（OR=0.27，95%CI：0.15~0.49，P<0.0001；P=0.11，I2=46.4%），在RT-PCR组，RRM1低表达/阴性表达组和高表达/阳性表达组缓解率分别是47.7%和27.7%（HR=0.34，95%CI：0.20~0.58，P<0.0001；P=0.17，I2=32.7%）。此外，RRM1低表达/阴性表达患者的OS比高表达/阳性表达患者长3.94个月（95%CI：2.15~5.73，P<0.001），7篇文献还分析了RRM1与TTP的关系，结果表明，低表达/阴性表达的患者的TTP比高表达/阳性表达的患者长2.64个月（95%CI：0.39~4.89，P=0.02）。

虽然该项meta分析结果提示RRM1低表达患者化疗后的ORR更高，预后更好，但是，2013年Bepler等［32］主持的一项大规模前瞻性RCT研究却得出了相反的结论。总之，目前的研究大多为小样本、回顾性的研究，对于检测RRM1表达可否预测化疗有效性尚未达成共识，更无法根据RRM1表达水平在临床实践中选择化疗方案。因此，尚需要更大样本、设计更合理、检测方法更标准和更具前瞻性的临床试验去探究RRM1表达与化疗疗效之间的关系。

（四）预测培美曲塞化疗疗效的生物标志物

胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）基因定位于人类染色体18p11.3，是由两个相同亚单位组成的二聚体蛋白。TS以5，10-亚甲基四氢叶酸（5，10-CH2-THF）作为甲基供体，催化脱氧尿嘧啶核苷酸（dUMP）形成脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP），在DNA的合成中起到重要作用［34］。TS也是多靶点抗叶酸药物培美曲塞的作用靶点。因此，TS也有可能成为预测培美曲塞化疗疗效的生物标志物。

1.TS对可切除肺癌化疗疗效的预测作用

目前研究发现，在大多数肺腺癌中TS表达低于肺鳞癌和SCLC，这可能是肺腺癌对培美曲塞敏感的主要原因，故TS对于预测培美曲塞的化疗效果可能具有一定的指导意义［28，35］。Zheng等［36］在一项回顾性研究中采用AQUA法检测了160例完全切除、但未给予辅助化疗的Ⅰ期肺癌患者中TS表达与预后关系的研究。结果表明，TS表达的最佳截断值是25%百分位数。TS≤57.02为低表达患者，这部分NSCLC患者MST为51.7个月，而TS>57.02为高表达，这部分患者具有更长的MST为81.3个月。Bepler等［28］在一项前瞻性研究中采用RT-PCR方法检测了35例接受吉西他滨联合培美曲塞新辅助化疗并手术切除的Ⅰb~Ⅲ期的NSCLC患者组织中TS表达。结果表明，TS低表达的患者对培美曲塞的敏感性更高，其ORR为38.8%，而TS高表达的患者ORR为29.4%（P=0.006），但二者OS和DFS均无明显差异。

2.TS在晚期肺癌中化疗疗效预测作用

Christoph等［37］采用免疫组化方法检测了207例接受培美曲塞化疗的晚期NSCLC患者中TS的表达并分析了其与培美曲塞化疗疗效的关系。该研究采用染色强度与染色面积乘积的中位值200来区分TS低或高表达。结果表明，TS低表达的患者对于培美曲塞化疗更加敏感，且比高表达的患者具有更长的中位PFS（5.6个月vs.3.5个月；HR=0.6379，P=0.0131）和中位OS（22.5个月vs.11.5个月，HR=0.5680，P=0.0107）。Sun等［35］采用免疫组化染色强度和面积乘积的半定量方法评价了285例接受培美曲塞化疗的晚期非鳞NSCLC患者中TS表达并分析了TS表达与培美曲塞化疗敏感性的关系，研究表明TS阴性表达的患者ORR为33.7%，而阳性表达者为14.1%（P=0.002），TS阴性表达者PFS为4.1个月，阳性表达者为2.0个月（P=0.001），可见TS低表达对培美曲塞敏感性增高，更能从培美曲塞的化疗中获益。

以上研究提示，TS低表达的NSCLC患者对培美曲塞敏感性更高，预后更好。但由于目前仅是少量小样本的回顾性研究，因此，对于TS表达与培美曲塞化疗疗效关系的研究也尚无定论，还需进行大规模临床试验来得出结论。

（五）预测抗微管类药物化疗疗效的生物标志物

微管蛋白3（tubulin beta-3，TUBB3）是细胞骨架的重要组成部分，参与了维持细胞形态、物质交换、信息传递和细胞有丝分裂等重要过程。紫杉醇促进微管蛋白聚合、抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂，从而导致细胞死亡，发挥抗癌作用。而长春瑞滨类药物和紫杉醇类作用相反，它可阻滞微管蛋白聚合形成微管并诱导微管解聚，阻止增殖细胞有丝分裂过程中纺锤体的形成，使细胞分裂停滞于有丝分裂中期而发挥抗癌作用。有研究提示NSCLC对两类抗微管类药物的化疗敏感性均与TUBB3表达水平有关，TUBB3有希望成为预测抗微管类药物化疗疗效的生物标志物。

1.TUBB3对可切除肺癌化疗疗效的预测作用

Seve等［38］采用免疫组化回顾性的检测了NCIC-JBR.10研究中265例可手术切除的Ⅱ期及Ⅲ期肺癌患者中TUBB3的表达，采用染色强度和面积乘积的二分法将其分为低表达组和高表达组。研究表明，在仅手术而未予长春瑞滨联合顺铂化疗患者中TUBB3高表达者无复发生存（replase free survival，RFS）和OS更差，但是在化疗组中则未观察到此差异。另外，接受化疗的TUBB3高表达的患者与单纯手术组相比，具有更高的RFS，OS也有延长的趋势，而低表达组则未见到此趋势。结果提示TUBB3高表达的患者更能从化疗中获益。该研究结果与在晚期肺癌中得出的结论相反，研究者认为，该结果尚需进一步证实，需要更多的随机临床试验和前瞻性的研究继续探讨TUBB3预测抗微管类化疗药物在NSCLC中的疗效。另外一项研究［39］则采用RT-PCR方法检测74例手术后接受顺铂联合吉西他滨、顺铂联合长春瑞滨和紫杉醇联合卡铂化疗的Ⅰ~Ⅳ期NSCLC患者中TUBB3表达并评价其与化疗疗效的关系，结果发现，TUBB3表达与患者的PFS和OS并无明显相关性。以上研究表明TUBB3在预测可切除肺癌化疗疗效中的作用仍存在较大差异，还需要多中心、大样本的临床试验去进一步证实。

2.TUBB3对晚期肺癌化疗疗效的预测作用

Rosell等［40］在一项随机临床试验中采用RT-PCR方法检测了75例晚期NSCLC患者TUBB3的表达情况并分析了TUBB3表达与化疗疗效的关系，其中22例患者接受吉西他滨联合顺铂化疗，25例患者接受长春瑞滨联合顺铂化疗，28例患者接受紫杉醇联合卡铂化疗。研究表明，TUBB3低表达患者较高表达患者对紫杉类、长春瑞滨等抗微管类药物更敏感，其中紫杉醇联合卡铂组缓解率更高（55.6% vs.9.1%，P=0.05），长春瑞滨联合顺铂组中TUBB3低表达者较高表达者TTP更长（7.3个月vs.4.1个月，P=0.03），在紫杉醇联合卡铂组也观察到此趋势（6.8个月vs.4.2个月）。Seve等［41］在一项回顾性研究中采用免疫组化方法，采用<50%阳性细胞得分为1和>50%阳性细胞得分为2的判定标准评价了93例接受了长春瑞滨化疗的晚期NSCLC患者中TUBB3表达与化疗有效性的关系，研究表明TUBB3高表达的患者较低表达者对长春瑞滨敏感性差。在>50%阳性染色患者中，47.7%的患者出现肿瘤进展，而在<50%染色患者中仅有18.7%发生肿瘤进展（P=0.009），而且TUBB3高表达者较低表达者具有更短的PFS（89天vs.208天，P=0.002）和OS（162天vs.306天，P=0.001）。

上述研究结果提示，在晚期NSCLC中TUBB3表达与抗微管类化疗药物敏感性呈负相关，TUBB3低表达患者预后更好，TUBB3也有望成为预测肺癌化疗敏感性的生物标志物，但是这些研究样本量较小，且判定标准不一，因此目前尚难以真正应用于临床实践。

（六）预测化疗疗效的其他生物标志物

1.p53基因突变在化疗疗效中的预测作用

p53基因是一种抑癌基因，定位于人类染色体17p13.1，编码一个53kDa的蛋白，被称为p53蛋白。p53基因在细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学过程中发挥着重要的作用。p53基因的突变是人类肿瘤的常见事件，几乎发生于所有肿瘤中，p53基因突变就会导致p53蛋白功能缺失，从而促进细胞增生，同时也导致作用于DNA的化疗药物的耐药性增加［42］。迄今，已经有许多研究表明p53基因突变与预后不佳有关。p53基因突变不但与肿瘤预后相关，而且也与化疗疗效有关，因为p53基因突变明显增加了肿瘤对化疗的抵抗性。Kandioler等［43］进行的一项临床研究评价p53基因突变在预测NSCLC化疗疗效中的作用。在这项临床试验中，有35例晚期NSCLC患者接受了3周期顺铂联合依托泊苷方案化疗和1周期同步放化疗，然后进行手术切除。研究应用直接测序法检测了肺癌组织中p53的表达，结果表明p53基因突变的患者对化疗明显抵抗，提示p53基因突变有望作为预测化疗疗效的一项指标。另外一项Ⅱ期临床试验则表明化疗联合注射野生型p53可以增加化疗敏感性并取得了较好的效果。该试验中19例肺癌患者接受多西他赛联合野生型p53治疗，而21例患者仅接受多西他赛治疗，在随访12个月后，多西他赛联合野生型p53治疗组MST为7.7个月（95%CI：4.53~10.84），而多西他赛组为5.9个月（95%CI：4.11~7.68，P=0.44）［44］。还有一项临床试验采取顺铂联合野生型p53治疗24例晚期NSCLC患者，其中17例疗效评价为疾病稳定（stable disease，SD），2例PR，4例疾病进展（progressive disease，PD）［45］。以上研究提示，化疗联合野生型p53有一定抗癌效果。

目前检测p53基因突变的方法主要是通过免疫组化检测p53蛋白。尽管大多数p53基因突变是错义突变，但仍有很多插入或缺失突变，导致形成截短蛋白，而免疫组化无法检测到截短蛋白，这就造成了一定的假阴性。同时，由于野生型p53过表达也会导致一定的假阳性，约为30%［46］，这可能是很多研究结果不一致的原因，而采用基因测序法则得出了比较一致的结果，但是，基因测序法对标本要求高，操作步骤烦琐，因此限制了其在临床中的应用［47］。

2.K-RAS基因突变在化疗疗效中的预测作用

K-RAS基因是RAS家族中的一员，定位在12号染色体上.是调节细胞生长和增殖信号的重要元件，平时RAS蛋白与GDP结合为非活化状态，当与GTP结合募集到细胞膜上时，K-RAS变为活化状态从而进一步激活多条信号通路如RAF/MEK/ERK、PI3K/AKT/mTOR和RAL进而调控细胞生长。平时K-RAS活性由GTP酶激活蛋白（GAP）和鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）调控，当K-RAS12、13或61密码子突变后，导致K-RAS活性持续激活，引起细胞增殖和凋亡抑制［48］。

目前在多种实体瘤中均发现K-RAS突变。研究表明15%~25%的NSCLC中存在K-RAS基因突变，是腺癌中突变频率较高的驱动基因之一［49］，其发生率大约为10%~30%，而在鳞癌中仅占5%，在吸烟的患者中更易发生［50］。近年来，关于K-RAS基因突变与肺癌患者化疗敏感性及预后之间的关系也有报道。

2005年，一项前瞻性随机对照临床试验［51］采用等位基因特异的寡核苷酸杂交方法检测了482例手术切除的Ⅰ、Ⅱ期NSCLC组织中K-RAS基因突变，并分析了K-RAS基因突变与化疗敏感性的关系。在该研究中，242例患者接受长春瑞滨联合顺铂化疗，而240例患者仅给予术后观察。结果显示，在两组中K-RAS突变率均为24%，在K-RAS野生型肺癌患者中，辅助化疗延长了OS（HR=0.69；95%CI：0.49~0.98，P=0.03），K-RAS突变型肺癌患者则无法从辅助化疗中获益（HR=0.95，95%CI：0.53~1.71，P=0.87），然而，交互分析表明，K-RAS基因突变并不是一个独立的化疗疗效预测因子（P=0.29）。另外一项回顾性研究［52］检测了IALT、ANITA（Adjuvant Navelbine International Trialist Association）和JBR.10数据库中1543例手术切除的早期肺癌中K-RAS基因突变状况，分析了K-RAS基因突变与化疗敏感性的相关性。在该研究中，763例患者仅接受术后观察，780例患者接受了辅助化疗，结果表明：无论是K-RAS野生型还是突变型患者均无法从辅助化疗中受益（HR=0.89，95%CI：0.76~1.05，P=0.15；HR=1.05，95%CI：0.76~1.46，P=0.37），并且两组患者的DFS也无明显差异。研究者认为K-RAS基因突变与肺癌化疗敏感性无明显相关。同样，也有研究评价了晚期NSCLC中K-RAS基因突变与化疗敏感性的关系，Camps等［53］开展的一项回顾性研究采用RT-PCR法检测了308例接受顺铂联合多西他赛化疗的Ⅲb和Ⅳ期NSCLC患者血清中K-RAS基因突变状况，评价了K-RAS基因突变与化疗有效性和预后的关系，结果显示，K-RAS基因突变患者的PFS为5.77个月，OS为9.07个月，而野生型患者分别为5.43个月（P=0.277）和10.03个月（P=0.514）。此外，一项回顾性研究［54］分析了162例晚期NSCLC患者K-RAS突变和化疗有效性之间的关系。研究表明，K-RAS野生型和突变型患者的ORR、OS及TTP均无明显差异，分别是26.5%和25%（P=0.87）、14.5个月和18.5个月（P=0.52）、4.2个月和4.7个月（P=0.42）。

总之，虽然K-RAS基因突变是NSCLC发生、发展中的常见事件，但通过以上研究可见，K-RAS突变与肺癌患者化疗疗效之间的关系尚无定论。为了进一步明确两者之间的关系，开展大样本、多中心的关于K-RAS基因突变与肺癌化疗疗效之间关系的RCT研究是今后NSCLC临床研究的重要课题。

3.CTCs在化疗疗效中的预测作用

近年来研究发现，检测血液中的循环肿瘤细胞（circulating tumour cells，CTCs）也在化疗疗效评估及个体化治疗中发挥着越来越大的作用。CTCs存在于肿瘤患者外周血液，不仅可以用于肿瘤患者的早期诊断，还可用于预测化疗药物敏感性及预后。已有研究表明，CTCs的数目是癌症患者预后的独立影响因素。因此，有研究者考虑通过实时监测CTCs中的生物标志物以更加精确的预测化疗疗效，从而对患者进行更加精准的个体化治疗［55］。Das等［56］检测了接受含铂化疗方案的转移性肺癌患者CTCs中ERCC1表达来评价其能否预测含铂方案化疗疗效。该研究共检测了17例患者CTCs中ERCC1的表达，以表达值1（范围0~30）作为截断值将ERCC1分为低表达和高表达。结果表明，ERCC1低表达患者较高表达患者PFS更长（266天vs.172天）。作者认为，检测CTCs中ERCC1的表达可以预测肺癌患者接受含铂方案的化疗疗效。但该研究样本量太小，导致统计效力不足，故尚需进行更大规模的研究。CTCs不仅能够预测肺癌患者化疗的疗效，也适用于预测其他肿瘤如卵巢癌患者的化疗疗效。研究表明CTCs中ERCC1阳性的卵巢癌患者对铂类化疗抵抗，预后更差［57］。虽然检测CTCs数目和其中生物标志物的表达有望预测化疗疗效并指导个体化治疗，但是，当前的检测技术水平尚不能覆盖所有肿瘤，在转移性肺癌中仅有不到20%的患者中能检测到CTCs，这就限制了该技术的大规模临床应用。相信随着更新的检测技术的出现，CTCs的检测率将会越来越高，从而更好地帮助临床医师进行肿瘤的诊断和个体化治疗。

（七）肿瘤生物标志物的检测及其影响因素

肿瘤生物标志物能否准确预测化疗疗效还取决于检测是否准确。肿瘤生物标志物的检测标本来源、检测方法、抗体特异性和质量、评定标准以及检测人员的操作质控等均有可能影响到结果的准确性。

目前，大多数检测标本是组织。但在晚期肺癌患者中通常无法取得手术标本，多采用气管镜下活检以及经胸壁穿刺的小标本，有时因组织块小，肿瘤细胞数少，质量不高（如严重挤压等）可能会影响检测结果。此外，福尔马林固定石蜡包埋的组织中mRNA降解严重，导致进行RT-PCR检测时提取的mRNA质量不高，也可能会对检测结果造成一定的影响。

检测方法不同也会对结果产生一定的影响。目前的检测方法主要包括RT-PCR、免疫组化、基因芯片以及Western blot等，这些方法各有利弊（表2-1）。在已经报道的研究中，大部分采用了免疫组化或RT-PCR方法。免疫组化简单易行，而且可以直观地显示被检测的肿瘤细胞阳性表达的面积和强度，但是，该方法也有其缺陷。一方面，它需要高度特异性的抗体；另一方面，还要有严格的质量控制，如免疫组化切片固定、抗原修复、非特性染色、抗体选择、结果判定及阳性对照等。不同的生产厂家其抗体质量不同，特异性也不一致。应用RTPCR法检测mRNA时，标本可能混杂肿瘤周围的正常组织；理论上，qRT-PCR法可以进行定量检测，但也仅为相对定量；生物标志物表达水平的截断值也不统一。这些均可能导致检测结果迥异，故而限制了这些生物标志物在临床中的广泛应用［58］。

理论上，生物体内蛋白的表达和mRNA的表达具有一定的相关性。免疫组化及RT-PCR技术分别检测生物标志物的蛋白和mRNA表达，这二者的检测结果是否具有一致性？哪个更可靠？两项meta分析研究表明，无论是应用免疫组化，还是RT-PCR方法检测ERCC1和RRM1的表达来预测它们与NSCLC化疗疗效之间的关系，其结论都是一致的［15，33］。一项研究［59］检测了石蜡包埋和新鲜冷冻的NSCLC组织中ERCC1的蛋白及mRNA表达水平。结果提示，二者具有一定的相关性（P=0.004），但是，在33%的组织中采用免疫组化检测结果显示ERCC1呈高表达，而qRT-PCR检测结果却呈低表达，同样，32%的组织中免疫组化检测结果呈阴性，而mRNA却显示高表达。Vilmar等［60］也采用免疫组化和RT-PCR技术检测了261例石蜡包埋NSCLC组织中ERCC1、BRCA1、TUBB3和RRM1的表达。结果并未发现蛋白表达和mRNA表达之间有相关性。两种检测方法结果不一致的原因可能有以下几点：①人工检测方法的误差以及生物机制如转录后调控、修饰等所致；②ERCC1存在同分异构体，但免疫组化可能无法检测到所有的同分异构体；③检测组织的质量不高也容易造成结果偏倚。

总之，目前的检测方法各有其优缺点（见表2-1），尚无证据表明哪种方法更具有优势。随着抗体制备技术的提高、新的定量技术以及免疫组化结果判定和质控标准的完善，相信会找到一种更合适的检测生物标志物表达的方法。

由于晚期肺癌患者的组织标本不易获得，研究者也在考虑其他可能的解决方法。众所周知，血液是肿瘤患者最容易获得的标本，检测血液中的肿瘤标志物不仅取材方便，还能多次取材，检测不同时期的生物标志物表达水平以指导临床治疗。临床实践表明，检测血中CEA、NSE等标志物在肺癌诊断、疗效及复发等的预测方面具有一定的作用。有研究比较了检测组织和血浆中EGFR敏感突变来判断肺癌患者对TKIs类药物的反应。结果提示，血液检测与组织检测的结果具有较高的一致性。尽管血液标本有诸多优点，但生物标志物在经过血液和淋巴循环后发生了不同程度的降解，浓度下降，可能无法完全反映真实情况。同样，血清生物标志物的截断值确定也是一个亟待解决的问题。

二、药物基因组学与肺癌生物标志物的筛选

（一）药物基因组学的概述

随着分子生物学和分子遗传学的迅猛发展以及人类基因组计划的完成，人类基因多态性不断被发现，药物基因组学（pharmacogenomics）应运而生。它主要从基因水平研究基因序列的多态性与药物效应多样性之间的关系，即研究基因本身及其突变体对不同个体药物作用效应的影响，并以此为平台开发药物，确定药物作用靶点，指导合理用药，提高用药的安全性和有效性，减少药物治疗的费用和毒副作用。

目前，以手术治疗为基础，联合放、化疗仍是NSCLC患者的基本治疗策略，但是在临床实践中发现不同患者采用相同化疗方案时，化疗疗效及不良反应存在显著差异，部分患者对化疗药物敏感，不良反应小，疗效较好，而有些患者则会出现原发性或继发性耐药，导致肿瘤迅速进展。研究发现，不同个体间的基因组差异是导致药物反应性个体差异的重要因素。因此，应用药物基因组学指导NSCLC临床个体化用药显得愈发重要。研究表明，造成药物反应个体差异的主要原因是基因多态性［61］（gene polymorphism），其中单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）是最常见的形式之一。根据基因多态性进行个体化治疗可以显著提高化疗药物的疗效及安全性，指导临床合理用药，使肺癌治疗具有更强的针对性，提高肺癌的治疗有效率，延长患者生命，提高生活质量。

（二）药物基因组学在肺癌化疗中的临床应用

1.根据基因多态性预测NSCLC化疗药物的疗效

顺铂是化疗的最基本药物，也是化疗的基石性药物。顺铂对NSCLC的作用主要是通过三条通路实现的：代表药物治疗靶点的核苷切割修复（nucleotide excision repair，NER）、在药物摄取中发挥作用的铜转运蛋白（copper transporter proteins，CTR）及在药物代谢中发挥作用的谷胱甘肽巯基转移酶（Glutathione S-transferase，GST）［62］。已有研究表明，基因多态性有助于预测铂类药物对NSCLC的化疗疗效。Ryu等［63］采用SNaPShot技术检测了109例接受含铂类化疗方案治疗的晚期NSCLC患者中ERCC1 Asn118Asn（C→T）、XPDLys751Gln（A→C）和Asp312Asn（G→A）的SNPs，研究表明，这三个SNP与含铂化疗方案的ORR无关。ERCC1 118 CC患者的中位OS明显长于ERCC1 118 TT+CT患者（486天vs.281天，P=0.0058）。但是也有研究得出了不同的结论，Ren［64］等分析了340例接受含铂化疗方案的晚期NSCLC患者ERCC1基因多态性与预后的关系，结果表明ERCC1 118 CT+TT患者OS较野生型CC基因型患者明显延长（18个月vs.13.8个月，P=0.014）。和ERCC1或XPF表达正常的细胞相比，两者之一表达缺失的细胞对顺铂的敏感性提高了40倍。Ludovini等［65］检测了192例接受含铂方案化疗的晚期NSCLC患者ERCC1 C118T和XPD Lys751Gln（AC）的基因多态性与化疗有效性和预后的关系。研究表明，ERCC1 C118T和XPD Lys751Gln（AC）基因多态性与晚期NSCLC患者ORR无明显相关；ERCC1 C118T基因多态性与NSCLC患者的OS和PFS之间也无明显相关性；XPD（Lys751Gln）CC型患者较（AA+AC）型患者的PFS更长（6.91个月vs.4.51个月，P=0.006）。铜离子转运蛋白1在细胞摄取铂类药物过程中起到重要作用，它可能与铂类药物化疗敏感性有关。一项研究纳入了282例来自中国的NSCLC患者，这些患者至少接受了2周期含铂方案化疗，目的是探究CTR1基因多态性与铂类药物疗效的关系。研究显示，对rs12686377位点来说，TT基因型患者可能对铂类药物敏感性更差（P<0.01）；对rs7851395位点来说，AA基因型患者OS更长，为16.57个月，而AG和GG基因型患者的OS分别为13.47和13.43个月（P=0.04）。单倍型分析表明GT单倍型对铂类药物更抵抗（P<0.05），而AG单倍型预后更好（P<0.05）［66］。GST是人体生物转化最重要的Ⅱ相代谢酶之一，能够清除内生和外来的毒素包括化疗药物；GSTs作用机制相对简单。GSTs与顺铂的去毒（detoxification）和促进顺铂-谷胱甘肽结合物（conjugates）形成（导致顺铂失活）密切相关。因此，被认为可能与铂类药物敏感性有关。GSTP1是GST家族的重要一员，是肺脏中含量最丰富的GST同型物；GSTM基因已被广泛研究，部分原因是由于它的多态性［62］。关于GSTP1基因多态性预测肺癌铂类有效性的研究也有所报道。1988年，Nakagawa等应用northern blot杂交技术发现在三株NSCLC细胞株中GSTP1mRNA水平显著高于SCLC；应用克隆形成实验确定了各种细胞株中顺铂的IC50，发现SCLC的IC50显著低于NSCLC，提示SCLC细胞株对顺铂的高度敏感性和低的GSTP1mRNA表达水平密切相关。1997年，Arai等发现GSTP1阴性的肿瘤对铂类的反应性明显好于GSTP1阳性者。作者又检测了接受顺铂/依托泊苷（足叶乙苷）化疗的60例（49例男性和11例女性）NSCLC患者的GSTP1表达水平，发现GSTP1阴性者中66.7%（16/24）的患者达PR，而GSTP1阳性者中仅25%的患者达PR。该研究提示，GSTP1表达水平与化疗敏感性密切相关。随后的研究发现GSTP1表达可能与原始耐药有关，而与获得性耐药无关。Sun等［67］研究了113例接受含铂方案化疗的晚期NSCLC患者的GSTP1基因多态性，旨在探讨其与含铂化疗方案疗效的关系。结果表明，rs1695位点AG+GG型患者对铂类化疗更敏感（P=0.022）。Zhou等［68］的研究也得出了相似的结论，AG+GG型患者与AA型患者相比，对铂类化疗更敏感。但是，Booton等［69］的研究并未发现GSTP1基因多态性与铂类药物敏感性之间存在明显的相关性。GSTM1也是GST家族的一员，同样与毒物清除密切相关。Li等［70］分析了217例NSCLC患者GSTM1基因的多态性，以观察其与铂类药物化疗敏感性的关系。研究表明，GSTM1缺失型患者的铂类药物化疗有效率为69.8%，而野生型患者仅为30.2%（P=0.004），提示GSTM1缺失型患者对铂类药物更敏感。迄今已经有许多关于基因多态性与肺癌患者铂类药物化疗敏感性关系的研究。尽管这些研究结果还存在一定的争议，但在NER通路中，ERCC1表达可能是预测顺铂疗效的最有希望的生物标志物；在铜转运蛋白通路中，CTR1、ATP7A及ATP7B可能成为前景最好的标志物组合模式；应用GST相关的生物标志物预测顺铂敏感性的研究结论莫衷一是［62］。针对上述标志物，尤其是ERCC1，开展大规模的RCT研究是今后肺癌个体化化疗研究的重点方向。

肺癌患者基因多态性与吉西他滨化疗疗效和预后也密切相关。Dong等［71］检测了56例接受吉西他滨化疗的晚期NSCLC中RRM1-37C→A，2455A→G和2464G→A三个位点的SNP。研究表明，-37CA、-37AA和-37CC患者的中位PFS分别是30.7、24.7和23.3周（P=0.043），但是2455A→G和2464G→A位点的基因多态性与患者的PFS无关。另外一项研究［72］则对298例接受吉西他滨或紫杉类药物联合顺铂的晚期NSCLC患者中RRM1基因多态性与化疗疗效及预后的关系进行了分析，结果表明，RRM1的10个SNPs与OS均无明显相关性。

关于应用基因多态性预测肺癌患者紫杉醇化疗疗效的研究也有报道。Lee等［73］检测了382例接受紫杉醇联合顺铂化疗的晚期NSCLC中基因多态性与化疗疗效及OS的关系。结果表明，BRCA1 rs799917C→T位点SNPs与化疗疗效明显相关（CT+TT型ORR为53.8%；CC型ORR为42%，P=0.02），与OS也密切相关（CT+TT型为15.3个月，CC型为12.7个月，P=0.03）。XRCC1 rs25487G→A基因多态性与化疗疗效也密切相关（GG+GA型ORR为49.9%，AA型ORR为23.8%，P=0.01）。而ERCC2 rs1052555位点C→T基因多态性与OS相关（CT+TT型为15.0个月，CC型为13.4个月，P=0.05）；TNFRSF1Brs1061624、BCL2 rs2279115、BIRC5 rs9904341和CASP8 rs3769818基因多态性也与OS相关，但与化疗疗效无明显相关。

肺癌患者基因多态性与培美曲塞的疗效和预后也有一定关系。Krawczyk等［74］检测了115例接受含培美曲塞方案化疗的NSCLC患者TS、MTHFR和ERCC1基因多态性，以研究其与化疗疗效及预后的关系。结果表明，TS基因多态性与含培美曲塞方案的疗效无明显相关，而具有5′-端非编码区（5′-untranslation region，5′-UTR）可变数目的串联重复（variable number of tandem repeat，VNTR）3R/3R型患者的PFS与2R/2R及2R/3R型患者无明显差异（分别为5.5、7和7个月，P=0.063），OS亦无显著性差异。关于MTHFR基因677位点C→T多态性的研究表明，TT型患者化疗有效率显著低于CC型或CT型患者，分别为23.1%、83%和98%（P<0.01），但PFS和OS无显著差异；作者汇总分析了TS VNTR和MTHER677C→T SNP，结果表明，CC+3R型患者PFS明显短于其他基因型（分别为5个月和7个月，P=0.003）。而ERCC1基因多态性与培美曲塞化疗疗效和预后之间无明显相关性。

2.根据基因多态性预测NSCLC化疗药物的不良反应

不同NSCLC患者的基因多态性与铂类药物毒性反应密切相关。对铂类药物毒性的研究集中在3′端非编码区C8092A和第118位密码子Asn118Asn（T19007C）这两个位点。多项研究结果显示，这两个位点与铂类的胃肠道毒性、肾毒性之间有一定关系。Suk等［75］对214例晚期NSCLC患者中ERCC1C8092A和T19007C基因多态性与铂类药物不良反应之间的关系作了相关性研究。结果发现，携带8092A突变等位基因的患者发生Ⅲ~Ⅳ度胃肠道毒性的风险是其他表型的2倍（P=0.03）。另外，Tzvetkov等［76］发现8092C等位基因携带者比AA基因型患者肾小球滤过率下降更为明显（P=0.047）。而Chen等［77］对95例NSCLC患者中ERCC1密码子118多态性与药物不良反应的关系进行了研究。结果并未发现该位点多态性与血液学毒性相关。另外，Tan等［78］研究发现CD74基因的rs2748249（C/A）和rs1560661（A/G）多态性位点与铂类药物的肝毒性显著相关，携带rs2748249（C/A）多态性的NSCLC患者使用铂类药物时更易出现肝毒性（OR=1.72，95%CI：1.24~2.39，P=0.001），而携带rs1560661（A/G）多态性的NSCLC患者则相反（OR=0.42，95% CI：0.25~0.70，P=0.00099）。Xu等［79］对282例采用含铂方案化疗的NSCLC患者的eIF3α的22个SNPs进行了研究，发现eIF3a Arg803Lys C>T位点多态性与铂类药物的毒性相关（P=0.02），携带该多态性的NSCLC患者对铂类药物引起的神经毒性耐受性好，而对其导致的耳毒性耐受性较差。目前也有研究发现，基因多态性可能与吉西他滨的吸收、代谢相关。Sugiyama等［80］研究了基因多态性与吉西他滨毒性之间的关系。该研究表明，影响吉西他滨清除率的主要因素是CDA多态性，如携带纯合体CDA *3（208G>A，Ala70Thr）的患者吉西他滨清除率下降64%；杂合体*3者则下降17%。表明CDA *3有望成为预测吉西他滨毒性反应的生物标志物。Tibaldi等［81］的研究则发现CDA Lys27Lys多态性与吉西他滨的严重骨髓抑制（如≥3级的粒细胞减少和血小板减少等）相关。

关于SNPs与紫杉醇毒性关系的研究偶有报道。Lamba等［82］研究发现药物转运蛋白ABCB1的SNPs与紫杉醇的骨髓抑制相关，其多态性位点rs2235015与血小板减少相关（P=0.04），ABCG2 SNP位点rs2231142与恶心等消化道不良反应相关（P=0.045），该基因的另一位点rs13120400则与感觉神经病变相关（P=0.027）。另外，与紫杉醇代谢相关的CYP遗传多态性与紫杉醇的不良反应的关系在乳腺癌、卵巢癌的研究中偶有报道，但在NSCLC中尚未见报道。

SNPs还有助于预测培美曲塞的不良反应。目前，该方面的研究主要集中在与培美曲塞毒性相关的TS基因型。Arevalo等［83］发现在欧洲人群中NSCLC患者中的TS基因多态性与培美曲塞毒性无显著关系。Wang等［84］在对NSCLC患者TS基因多态性与培美曲塞敏感性和毒性关系的研究中发现，-6bp/-6bp基因型患者比-6bp/+6bp基因型患者在接受培美曲塞化疗过程中更易出现药物不良反应，但差异无统计学意义。

基因多态性与伊立替康不良反应也密切相关。Nakamura等［85］分析了78例接受伊立替康+紫杉醇/吉西他滨化疗NSCLC患者的不良反应与SNPs的关系。研究表明，化疗期间最常见的严重不良反应是4级中性粒细胞减少（分别是36.8%和10.0%），这与UGT1A1*6和UGT1A1*27基因型有关。另外，Hoskins等［86］对一项纳入9项临床研究中的821例患者进行荟萃分析时发现基因型UGT1A1*28为伊立替康导致严重腹泻的危险因素（RR=4.606）。

（三）全基因组关联研究在药物基因组学中的应用

近年来，全基因组关联研究（genome wide association studies，GWAS）成为肺癌等复杂性疾病遗传易感性、药物敏感性及患者预后研究中强有力的工具。GWAS是利用高通量的基因型检测平台在全基因组范围内同时研究几十万甚至上百万个SNPs，在较大样本量的研究对象中筛选与疾病或性状显著相关的SNPs位点，并利用一个或多个独立人群进行验证，最终确定与疾病遗传易感性相关的SNP位点。GWAS在系统筛选的基础上，通过严格的质量控制、统计检验以及独立的人群验证能够有效控制假阳性率，确保研究结果的真实性，提高研究结果的可靠性。

Sato等［87］研究了以卡铂化疗为主要治疗方案的105例日本晚期肺癌患者基因组遗传改变与肺癌患者预后之间的关联，发现EIF4E2、ETS2和DSCAM基因的遗传变异可能影响肺癌患者的预后。Wu等［88］对美国M.D.Anderson癌症中心接受铂类化疗为主的327例晚期NSCLC患者进行GWAS与患者预后的研究，然后进一步在420例西班牙肺癌患者和美国Mayo医学中心的315例肺癌患者中进行了验证。该研究发现染色体12q23.3区域遗传变异与接受铂类化疗为主的NSCLC患者OS显著相关。Xu等［89］对接受以铂类化疗为主但未接受手术的147例晚期NSCLC患者进行了GWAS分析与预后的研究，发现NBS1基因变异可能与NSCLC预后相关，有望成为预测铂类化疗药疗效的生物标志物。

三、小结

生物标志物一直是肺癌诊断和治疗研究的热点。以ERCC1为代表的生物标志物曾经仿佛使人们看到了预测化疗疗效、不良反应及预后的希望的曙光，既往的NSCLC治疗指南也曾经推荐检测ERCC1和RRM1水平等以预测铂类和吉西他滨等化疗药物的疗效，但近年来大量研究的结果却莫衷一是，故目前所有新版的肿瘤治疗指南均不推荐应用上述生物标志物来指导临床用药。造成上述结果的原因可能有检测方法不一致、结果判断标准各异、抗体的特异性不理想、实验的质控不严格等。近年来关于药物基因组学在预测化疗药物疗效和不良反应方面的研究取得了较大的进展，为临床医师选择高效、低毒的化疗方案提供了强有力的工具，而GWAS进一步提高了研究的可靠性。

总之，应用生物标志物和药物基因组学预测化疗药物疗效迄今尚未达成共识。正如2010年ASCO大会上Harvey Pass教授所言，目前应用生物标志物预测化疗疗效这一领域尚为“一潭浑水”（a muddy water）。当然，这并不意味着检测ERCC1等肿瘤生物标志物和基因多态性对化疗方案的选择毫无意义。今后应开展更多的大样本、前瞻性、多中心、设计更合理的RCT研究，尤其要特别重视组织标本获取、检测方法及结果判定的标准化、试剂质量及实验室质控等问题，及时采用新的更好的检测方法，并应用循证医学的方法对获得的结果进行充分的验证。相信随着精准医学计划的开展，将极大地推动以基因组学为基础的新药研发和药物基因组学检测。可以预见，将来我们在开具处方前，将需要查阅患者的药物基因组学信息并据此调整用药方案。

（张学德　杨拴盈）

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