传统的细菌学研究方法包括显微镜技术、培养和鉴定技术，这些技术存在着很大的限制，首先是他们的敏感性不高，对不能培养的细菌和未知的菌种无法检测；其次是需要的时间长，受多种因素的影响，重复性和定量差；此外由于各个菌种的生长速率和需要的条件不同，定量的准确性不高。为了克服这些障碍，基于检测细菌16S rDNA基因的分子生物学技术应运而生，目前已经成为微生态学研究的主要方法之一。

细菌16S rRNA由1500个核苷酸组成，分子量相对适中，具有保守区和可变区交错排列的独特结构，是理想的靶分子。保守区核苷酸序列具有高度保守性，存在于所有细菌中，不同科、种、属间细菌16S rRNA基因同源性达97%以上；可变区存在9个变异区（V1～V9），不同科、种、属间都具有一定的差异，这些差别构成了研究细菌群进化分类的依据，16S rRNA基因被认为是细菌分类和鉴定的金标准（gold standard）。目前，几乎所有的已知细菌的16S rRNA基因的碱基序列都已被测定并保存于基因库中。由于RNA易于降解，因此多采用检测16S rRNA所对应染色体上的DNA序列（16SrDNA）。16S rRNA可直接从DNA中转录直接测序，因此通过设计针对不同科、种、属的16S rRNA 的特异引物进行PCR扩增，综合多种分子生物学的分析方法，可以实现对肠道菌群中某些细菌甚至整个微生态系统的动力学变化进行监测，揭示肠道微生物系统种群的多样性、数量和动力学，能对这个复杂的微生态系统进行更加全面的分析，这些技术扩展了我们对那些已证实难以培养但对胃肠道生理学有重要意义的微生物的认识。

聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction，PCR）即聚合酶链式反应，是1985年由美国化学家Kary Mullis发明的，因此他获得了1993年诺贝尔化学奖。PCR是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性（denaturation）：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）（annealling）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸（extension）：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2 ⁿ的形式增加。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

参加PCR反应的物质主要有五种，即模板DNA （Template）、引物（Primers）、四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）、Taq DNA聚合酶（Taq polymearse）和含有Mg ²⁺的反应缓冲液。其中引物是PCR特异性反应的关键，所谓引物就是与待扩增DNA片段两翼互补的寡聚核苷酸，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制，模板核酸的量与纯化程度是PCR成败与否的关键环节之一。

PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA，具有特异性强，灵敏度高，简便、快速，对标本的纯度要求低等特点。已经广泛用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面，也广泛地应用于临床诊断。以PCR技术为基础针对16S rRNA基因的检测已经被用于粪便中各种细菌的检测和研究。

基因指纹图谱是用PCR扩增环境微生物样品总DNA的标记序列，然后用合适的电泳技术将其分离而成的具有特定条带特征的图谱。基因指纹模式的不同反映种群结构的不同。按分离依据不同，基因指纹图谱可分为变性梯度凝胶电泳图谱和DNA长度多态性分析图谱。

变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技术是由Fischer于1979年提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。1993年，国外学者Muyzer等将DGGE技术应用于微生物生态学研究，证实了该技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。DGGE通过核酸信息对微生物群落进行表征，较传统的菌种分离培养技术更快捷并能鉴定出不可培养细菌，是研究肠道菌群的最普遍的指纹方法。其原理是从胃肠道标本中提取总DNA，在引物的5′端加入30～50bp的GC片段（GC-clamp），对16S rRNA基因进行PCR反应，把带有较高解链温度GC片段的扩增产物放到有梯度的尿素和甲酰胺作为变性剂的聚丙烯凝胶中进行电泳，部分解链的双链DNA分子的电泳迁移率降低，而且序列不同的DNA分子的解链速度和程度不同，它们在凝胶的不同位置停止迁移，从而使不同序列的DNA分子分开，产生细菌群体的图谱，理论情况上，在恰当的条件下，只要有一个碱基对的差异即可将细菌群体相互分开。Jens W等用PCR-DGGE法分析人类粪便中的乳酸菌（ Lactobacillus）、微球菌（ Pediococcus）、明串珠菌（ Leuconostoc）以及魏斯菌（ Wessella），实验表明，lac1、lac2 GC这对引物可以很好地分离不同的DNA片段，该法提供了检测肠道微生物菌群状态以及演替的简便、快捷又可靠的方法。但Vallaeys等发现，DGGE并不能对样品中所有DNA片段进行分离，只能对微生物群落中数量超过1%的优势种群进行分析，但是通过使用属或种的特殊引物可检测到胃肠中数目较少的菌属，比如双歧杆菌，尤其是乳酸杆菌的敏感性。因此该方法有可能用于测定摄入的益生元和益生剂，如双歧杆菌等原籍菌以及测定益生菌菌种自身，有报道显示，DGGE图谱显示同时摄入益生元和益生剂（合生元）并不能增加益生菌在受测个体胃肠中的定植。

温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）是利用不同构象的DNA分子具有不同的变性温度（Tm）来进行分离。与DGGE不同的是凝胶中所采用的是温度梯度以及在引物的5′端加入30～50bp的GC片段。16S rRNA基因进行PCR后扩增产物带有较高解链温度GC片段，在不同温度梯度的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，由于序列不同的DNA分子的解链速度和程度不同，它们在凝胶的不同位置停止迁移，从而使不同序列的DNA分子分开并留下指纹印迹。LIONETT等运用该技术对儿童克罗恩病患者的肠道营养和微生物群落进行了研究。

限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）是利用特定的限制性内切酶切割扩增产物，再将产生的长短、种类、数目不同的限制性片段，用琼脂糖凝胶电泳分开它们，从而生成一特征性的限制性片段长度多态性。由某一限制性内切酶产生的片段大小和数目在不同个体中即表现出差异，对每一个DNA限制性内切酶组合来说，所产生的片段都是特异性的，该方法适合于复杂菌群的研究，是一种快捷且具有可重复性的方法，可以被用于跟踪复杂菌群如肠道中特定细菌的动力学变化。末段限制性长度多态性（termina1-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）与16SrDNA相结合进行分析的方法已经广泛应用于粪便菌群的分析。柳欣源等收集18名成年志愿者新鲜粪便采用T-RFLP技术特异性地分析柔嫩梭菌类群的组成，其结果与DGGE的分析结果具有较好的一致性，而且显示T-RFLP方法重复性高，最低能检测到群落中1%的细菌，能够对大量肠道样品中柔嫩梭菌类群的结构进行快速、有效的筛查和比较。Leser等采用T-RFLP的方法对饲喂不同日粮的生长猪的肠道菌群进行指纹分析发现，给猪饲喂标准日粮或补充高纤维的日粮，2周后不同处理的猪结肠中菌群的结构不同。同时这项技术还用于鉴定人类粪便中的双歧杆菌以及益生菌乳酸菌种的示踪观察与抗生素介导的肠道菌群的变化。

随机扩增多态性技术（random amplified polymorphic DNA，RAPD）是通过随机设计的短的引物来随机扩增基因组DNA片段，由于非特异的引物可以结合在模板DNA的多个位点，产生多个PCR产物，经电泳分离开和溴化乙锭染色，即可直接检测DNA多态性，用于DNA指纹分析。一些研究中认为RAPD适合于作为筛查工具，而RFLP适合于确诊方法。

扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是一种新的指纹图谱技术。AFLP是利用PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记。

16S rRNA靶寡核苷酸探针杂交已成为对天然样品中个体细胞鉴定非培养的直接方法，该项技术提高了人们对复杂的微生态系统细菌汇编程序和菌群的动力学的认识。16S rRNA分子具有遗传稳定性，由保守区和可变区组成，其高保守区域可用于设计特异性区域探针，比如EUB338/EUBⅡ/EUBⅢ可以用于绝大多数细菌，最常用于杂交技术的生物标记物，而针对每个分类学的特定探针，在细菌和原核生物之间，以至属特异性和种特异性，均可按照16S rRNA高度可变区进行设计，随着16S rRNA序列的可用性增加，其非常有助于杂合方法的发展和其在不同微生态系统中的应用。

斑点杂交（dot-blot hybridization）是检测未经分离核酸样品中特异DNA序列的简便方法。目的DNA通过加热和碱变性后将其水溶液（如基因组DNA和总RNA）直接点样于硝酸纤维膜或尼龙膜上，使之干燥。然后与含有单链标记探针的杂交液杂交适当的时间，洗去游离探针后，放射自显影。若检测其放射强度，则可定量检测标本中目的DNA的量。在一项细菌RNA的研究中，应用分离的粪便RNA标本，与两张尼龙膜上一系列的放射性标记的寡核苷酸探针的混合物进行杂交（每一个探针代表一个特殊的菌群）。总的标本的RNA的量用能杂交到大多数细菌的保守rRNA序列的通用探针作为参考，与其他探针的杂交结果相比较，这个方法提供了一个计算不同细菌占所有细菌中的比例的一个方法。

荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）是将带有荧光标记的寡核苷酸探针直接与固定在载玻片上的经过处理后的细胞进行杂交，固定过程中要使短的探针渗透到细胞内的核酸，用荧光显微镜即可观察到带有杂交荧光标记探针的细胞，荧光原位杂交为研究肠道菌群的组成提供了新的更为方便的方法。Franks等设计了6种针对人的粪便中主要几种细菌的16S rRNA的寡核苷酸探针，采用FISH方法定量检测了几种细菌的数量。该方法优点是在保持组织结构和细胞的原貌情况下能特异性显示检测目标与组织细胞的结构关系，为研究肠道细菌之间、肠道细菌与肠道组织的结构功能提供了途径。FISH在应用中也存在一些问题，探针对于不同类型细胞壁的穿透能力不同，可能会对革兰阳性细菌的检测出现低估，并且探针结合目标位点的特异性依赖于杂交和洗涤的条件。

DNA芯片（DNA microarray，DNA chips）技术为检测和评价复杂微生态系统中微生物的多样性提供了快速、高效的方法，其原理是基于分子杂交技术，从样品中分离出总DNA或rRNA，粉碎后采用PCR方法与已经标记的核苷酸同时进行扩增或直接进行化学标记，标记的片段与固定于表面的探针进行杂交，杂交片段经洗膜后进行荧光标记。将芯片技术应用到人肠道菌群的研究正在进行中。徐晓静等利用16S rRNA的保守区和可变区设计制备的基因芯片在4小时内就能完成沙门菌属、志贺菌属、葡萄球菌属和耶尔森菌共4个菌属的23株肠道菌及相关细菌的杂交检测，每种细菌均呈现出具有各自特征的杂交结果，而且无其他探针产生阳性信号。

竞争性PCR（competive PCR）的原理是通过在模板中加入一种特殊的已知浓度的模板一起进行PCR扩增，根据两者扩增产物的长度不同利用琼脂糖电泳检测灰度，从而达到定量的目的。Pintado等发现，将竞争性PCR与DNA指纹技术（DGGE）结合也可用于菌群定量分析，这种技术的优点是待测模板与竞争性模板的PCR扩增产物可以有相同的长度，而且可以在菌株水平上定量。

荧光定量PCR（FQ-PCR）是美国于1996年推出的一种新的核酸定量技术。它可以在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增产物量的变化，再通过最后得到的ct值和建立的标准曲线，对起始模板进行定量分析。目前最常用的方法是SYBR Green荧光染料和Taqman荧光探针两种方法。FQ-PCR技术融合了PCR技术和DNA探针杂交技术的优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化使PCR的扩增及其分析过程均在同一封闭系统下完成，并在电脑分析软件支持下实现对PCR扩增产物的动态监测和自动定量，具有良好的灵敏性、特异性、精确性和重复性，且降低了标本和产物的污染，无复杂的产物后续处理过程，高效、快速等优点。Malinen E对SYBR Green荧光染料和Taqman荧光探针两种方法在灵敏性方面进行比较，并没有发现明显差异，在特异性方面Taqman荧光探针因为具有特异性引物和特异性探针，表现出了更高的特异性。另外Taqman探针结合不同的荧光基团，用于一个反应体系的多重检测，也表现了较高的特异性，且步骤简洁、高效，可以用于大规模样本的研究。

国内杨美芬等应用SYBR Green荧光染料方法对轮状病毒性肠炎患儿肠道的双歧杆菌、乳酸杆菌和大肠埃希菌进行了定量分析，并和同年龄同性别的正常儿童菌群进行比较，其结果和其他文献报道的用培养的方法得到的结果接近。马卓娅等通过设计大肠埃希菌和双歧杆菌特异性Taqman探针，利用FQ-PCR方法比较湿疹患儿与正常儿童粪便中肠道菌群双歧杆菌和大肠埃希菌的差别，结果显示湿疹患儿粪便中双歧杆菌的含量明显少于正常儿童，而大肠埃希菌较正常儿童增多。

克隆文库分析法是PCR扩增环境微生物样本DNA的带有进化信息（或其他标记基因）的片段，将这些片段克隆进合适的载体，构建克隆文库以分离不同的序列，然后对分离的序列采用测序技术或PCR/RFLP进行定性分析。对于测得的序列，可以通过与GeneBank数据库中已有数据的对比鉴定其分类地位，许多序列可以鉴定到种的水平。通过分析rRNA片段的类型和出现频率，可以得到微生物群落结构和多样性的信息。克隆文库分析法只有在分析的克隆数目足够多的情况下，才可以比较完整地认识种群组成的情况，并且PCR和克隆策略引入的误差会对克隆出的rDNA序列及其鉴定产生重要影响，因此，种群多样性从总体上讲并不真实。另外，克隆文库分析法成本高，工作量大，分析时间长，不适合对微生物群落结构变化进行动态跟踪研究。

总之，应用16S rRNA作为研究对象，采用以PCR为基础的多种分子生物学分析手段的联合应用，可以快速、微量、准确地对肠道微生物进行检测，不仅可以对肠道细菌组成及数量进行测定，还能对细菌的活性进行分析。目前虽然由于受条件限制这些技术尚未广泛常规开展应用于临床，相信随着时间推移，这些检测分析技术将很快开展并服务于临床工作。基于检测细菌16S rDNA基因的分子生物学技术见表4-1。选用何种方法取决于研究的目的，PCR-DGGE/PCR-TGGE以及T-RFLP等指纹图谱技术可以最大限度显示复杂菌群的概貌，主要用于菌群结构的动态变化研究，但通常不能定量；而FISH和定量PCR能够对一种或几种细菌进行定量，但受到检测数量的限制，不同的菌种具有不同的16S rDNA基因；并且上述基于PCR的技术均存在分辨率低的缺点，因为PCR仅能够对菌群中含量高的细菌进行扩增；基因芯片技术能够检测各种细菌的标记基因，但只能够检测已知的参考序列。值得注意的是所有基于PCR的研究技术，由于引物的特异性和反应条件的差别，均存在PCR偏倚。