- 性传播疾病实验室检测指南
- 中国疾病预防控制中心性病控制中心
- 6937字
- 2021-04-01 08:56:36
第六节 抗菌药物敏感性检测
淋球菌抗菌药物敏感性检测（药敏检测）的方法主要有定性检测和定量检测两大类，定性检测包括纸片扩散法；定量检测包括琼脂稀释法、梯度扩散法（E-test）和微量肉汤稀释法。
一、纸片扩散法
1.检测原理
纸片扩散法又称Kirby-Baure纸片扩散法（简称K-B法），将含有一定量的抗生素纸片，贴在已涂抹被测菌株的培养基上。经培养后，药物纸片周围形成透明的抑菌圈，根据抑菌圈大小判断药敏结果。
2.检测准备
（1）CO 2培养箱、麦氏管（McFarland管）、比浊仪或分光光度计。
（2）GC琼脂基础培养基+1%生长添加剂或10%羊血。
（3）药敏纸片，MH肉汤或无菌生理盐水。
3.标本采集
临床标本经选择性培养基分离培养后的纯菌落。
4.检测流程 （1）制备菌悬液：
以选择性培养基对样品分离培养后，挑取疑似单个菌落转种到非选择性培养基中，经16～18小时培养后，用接种环挑取新鲜菌落，悬浮于无菌生理盐水中，校正菌悬液浓度至10 8CFU/ml（相当于0.5个麦氏管浓度，或用分光光度计调整OD 600至0.15左右）。
（2）接种：
取预先配制的巧克力平板置室温备用。用无菌棉拭子蘸取菌悬液后，在试管壁处旋转挤压几次，除去多余的菌液，用棉拭子均匀涂布于整个培养基表面反复数次，每次将平板作60°旋转，最后沿平板周边绕两圈，保证平板涂布均匀（或于90mm平板中滴入500μl菌悬液、150mm平板中滴入1 400μl菌悬液，再用涂布棒将菌悬液涂匀整个平板）。
（3）贴加纸片：
平皿在室温中放置不超过15分钟，待表面的水分被琼脂完全吸收后贴加已经室温平衡的药敏纸片。用无菌镊子取1张药敏纸片，平贴于培养基表面，用镊尖轻压纸片以保证与琼脂表面完全接触。
（4）孵育后观察结果：
将贴好药敏纸片的平皿放置15分钟，再将平板反转倒置，在（36±1）℃、5%±1% CO 2、70%～80%湿度环境中培养16～20小时后观察结果。
（5）结果判读：
培养后取出平板，测量抑菌圈直径（非抑菌环直径），以mm为单位记录结果。抑菌圈边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。参照CLSI M100淋球菌抑菌圈直径解释标准和相对应Cut-off值（表2-2）判断敏感、中介和耐药。
表2-2 淋球菌抑菌圈直径解释标准（CLSI M100 29 th ed标准）
记录结果时先读取参考菌株ATCC 49226的抑菌圈直径，若其在标准范围内则表明本次试验有效；参考菌株抑菌圈直径超出上述范围则表明本次试验无效，需重新测定。参考菌株ATCC 49226的抑菌圈直径范围如表2-3所示。
表2-3 淋球菌参考菌株ATCC 49226的抑菌圈直径范围值
5.结果报告
按照抑菌圈直径的大小判断敏感（S）、中介（I）和耐药（R）。
6.临床意义
（1）K-B法操作简单，适合临床分离单个菌株对多种不同抗生素的敏感性检测，指导临床用药。
（2）K-B法试验结果与临床治疗的关系如下
1）敏感S：表示感染可以使用推荐剂量（常规剂量）的该抗生素进行治疗，失败的可能性小于5%，有用药禁忌者除外。
2）中介I：药物浓度在生理性浓集部位具有治疗效果，或高于常规剂量也可有临床疗效。
3）耐药R：是指常规剂量抗生素不能抑制被测菌的生长，其临床疗效并不可靠，临床治疗的失败率大于15%。
7.注意事项
（1）菌悬液应在15分钟内使用。
（2）用于淋球菌测试的抗生素有五大类，每类药中只需要选一种为代表进行试验，其敏感程度即可代表同类其他药物。主要是：青霉素类；四环素类；氨基糖苷类（如大观霉素）；第三代头孢菌素类（如头孢曲松）；喹诺酮类（如环丙沙星）；大环内酯类（如阿奇霉素）。根据临床的需要再增加合适的抗生素。
（3）纸片必须放置在有干燥剂的容器内低温保存，只拿出少量放4℃备日常工作用。装纸片的容器从冰箱取出后，必须室温放置10分钟以上才可打开，以防止潮解。
（4）纸片一旦贴上培养基表面就不可再移动，每张纸片的间距不少于24mm，纸片中心距平皿的边缘不少于15mm。直径为90mm的平皿所贴纸片不多于4张，若同时贴头孢菌素类的则不多于3张。直径为150mm的平皿所贴纸片不多于9张。
（5）在透明抑菌环内有明显单个菌落，都应重新鉴定并重复试验。
（6）使用标准菌株作对照，只有当标准菌株的药敏结果在受控范围内时，检测结果才有效；若发现标准菌株的药敏结果不在受控范围，应认真分析原因后重新检测。
二、琼脂稀释法
琼脂稀释法有CLSI及WHO方法，我国淋球菌耐药监测项目中参考的是WHO方法。
1.检测原理
琼脂稀释法是淋球菌药敏检测的金标准方法，抗生素以倍比稀释的方法加入到培养基中，待测菌接种于含不同浓度的抗生素培养基上培养，依据待测菌在培养基上的生长情况确定该种抗生素的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。
2.检测准备
（1）CO 2培养箱、麦氏管（McFarland管）、比浊仪或分光光度计。
（2）抗菌药物、MH肉汤（或无菌生理盐水）。
（3）GC基础培养基+1%生长添加剂或10%的脱纤羊血。
3.标本采集
临床标本经选择性培养基分离培养后的纯菌落。
4.检测流程 （1）菌悬液的制备：
刮取在非选择性培养基上生长18～20小时的培养物，在管壁上充分研磨混悬于1ml无菌生理盐水（或MH肉汤）中，用比浊仪调菌悬液浓度至0.5麦氏单位（或用分光光度计调整OD 600至0.15左右），再用无菌生理盐水（或MH肉汤）稀释10倍至浓度为10 7CFU/ml。于15分钟内用多点接种仪接种（放置室温应大于25℃）。每个待测菌接种至培养基表面的菌量为10 4 CFU。
（2）抗生素溶液的制备 1）抗生素储备液制备
抗生素称量及配制：根据各抗生素的纯度称取，按照溶解所需溶剂（表2-4）和所需浓度溶解抗生素至储备液浓度。
表2-4 用琼脂稀释法测定淋球菌MIC时制备抗生素溶液所用溶剂
分装与保存：混匀后分装，每管200μl，-70℃可保存一年。
2）抗生素工作液制备：
按照倍比稀释的方法将抗生素储备液稀释至工作浓度。
（3）含抗生素浓度梯度的系列培养基的制备
1）培养皿编号：按各抗生素浓度编号。
2）将配制好的各抗生素工作液200μl加到各培养皿中，与20ml 50℃预温的培养基充分混匀，平放在超净台内，半开培养皿盖至培养基凝固后，用塑料袋密封保存于4℃冰箱。
（4）菌悬液接种与培养：
多头接种针以及菌液板用高压法灭菌处理，其他配件用乙醇消毒处理；使用前必须确认完全烘干。按照仪器要求将配制好的待测菌悬液和参考菌株菌悬液（1～2μl）接种于各平板，接种后置超净台内直至菌悬液渗入；放置于（36±1）℃、5%±1%CO 2、70%～80%湿度环境中培养20～24小时观察结果。
（5）结果判读：
记录结果读取时间，观察细菌生长情况：在适宜的光线下，观察对照培养基上的菌落生长情况，如对照培养基上菌落未生长，则本批试验结果无效；对照培养基上生长良好，则观察含抗生素的培养基上菌落生长状况：接种点内有1个以上菌落或呈菌苔状为生长；接种点内无任何菌落或呈薄雾印迹为无生长。根据WHO西太区淋球菌抗菌药物敏感性的判断标准（表2-5）对待测菌株进行耐药结果判断。
表2-5 WHO西太区淋球菌抗菌药物敏感性的判断标准
记录结果时先记录参考菌株的MIC值，参考菌株MIC值在标准MIC值范围内或在标准MIC值±1个浓度梯度范围内表明本次试验有效；参考菌株MIC值超出上述范围则表明本次试验无效，需重新测定MIC值。参考菌株的MIC值范围如表2-6所示。
表2-6 淋球菌参考菌株的MIC范围值（WHO西太区标准）
注：DS（decreased susceptibility）：低敏，指菌株对广谱头孢菌素类抗生素的敏感性降低
5.结果报告
能够抑制淋球菌生长的抗生素最低浓度即为该抗生素的最低抑菌浓度，记录MIC值，以mg/L为单位，并根据WHO耐药判定标准进行耐药（R）、低敏（DS）和敏感（S）结果报告。
6.临床意义
琼脂稀释法是淋球菌药敏检测的“金标准”方法，可以准确测定抗生素的MIC值，并可作为其他测定方法的参比法，主要用于我国的淋球菌耐药监测项目。但该方法操作较为耗时烦琐，不用于临床样本的常规检测。
7.注意事项
（1）抗生素制备时要参考抗生素粉的纯度，计算时要按照实际有效重量进行配制。有些抗生素不稳定（如青霉素），抗生素培养基尽量新鲜配制，配制后尽快使用。
（2）抗生素溶解时，不同抗生素使用的溶剂会有所不同，配制后的保存方式也会不同，如保存温度、是否需要避光等，要按照试剂生产商的说明操作。
（3）培养基中加抗生素时，要保证培养基温度已降至50℃左右，以免高温导致抗生素效价降低。
（4）配制的药敏板一旦凝固，应立即用塑料袋包好并放置于4℃保存，其有效性可维持2周。配制药敏板的同时需准备不含抗生素的平板作为阴性对照。
（5）接种菌液前要确保培养基表面干燥，可以将打开培养皿盖的培养基倒置于培养箱中15～30分钟预温烘干。
（6）接种时从空白对照培养基开始，从低浓度向高浓度依次接种菌液，全部接种完成后，要再接种一块空白对照培养基，以保证整个试验没有污染。
三、梯度扩散法（E-test）
1.检测原理
E-test结合了琼脂稀释法和纸片扩散法特点，由一个含有梯度抗生素的塑料薄条构成。当E-test试条被放在一个已涂抹淋球菌的琼脂平皿时，其载体上的抗生素迅速地释放入琼脂介质，从而在试条下方建立了一个抗生素浓度的连续梯度，经过孵育后，即可见一个以测试条为中心的对称的椭圆形抑菌环，抑菌环与测试条交叉点上的浓度示值即为MIC值。
2.检测准备
（1）CO 2培养箱、麦氏管（McFarland管）、比浊仪或分光光度计。
（2）GC基础培养基+1%生长添加剂或10%的脱纤羊血，MH肉汤（或无菌生理盐水）。
（3）不同抗生素E-test测试条：测试条的一面标有以μg/ml为单位的MIC判读刻度，测试条柄端用字母代码表示抗生素的种类，测试条的另一面固定有一个预先制备的干燥而稳定的抗生素浓度梯度（比如0.016～256mg/L），浓度由高到低按照对数梯度递减。
3.标本采集
临床标本经选择性培养基分离培养后的纯菌落。
4.检测流程 （1）检测前准备：
提前将E-test测试条及待接种平板放置于室温中预温30分钟。
（2）菌悬液的制备：
刮取在非选择性培养基上生长18～20小时的培养物，在管壁上充分研磨混悬于1ml无菌生理盐水（或MH肉汤）中，用比浊仪调菌悬液浓度至0.5麦氏单位或用分光光度计调整OD 600至0.15左右（菌液浓度10 8 CFU/ml）。
（3）菌悬液涂布：
用棉拭子蘸取菌悬液，在管壁上略挤干拭子，然后用拭子在培养基表面均匀涂布，涂布后晾置约10分钟，使平板表面干燥。
（4）贴条与培养：
用镊子将测试条放在已晾干的平板上，一端接触平板后缓慢放下另一端，以保证测试条与琼脂平板紧密接触无气泡，如果有气泡产生，可用镊子轻压测试条表面以驱赶气泡。试条的刻度面应朝上，药物最高浓度应靠平板边缘，试条一旦贴上琼脂表面就不能再移动。一般90mm平板可平行贴试纸条1条，150mm平板可放射状贴试纸条4～5条。贴条后的平板放置15分钟，然后放置于（36±1）℃、5%±1% CO 2、70%～80%湿度环境中培养18～24小时观察结果。
（5）结果判读：
记录结果读取时间，观察细菌生长情况：培养后围绕测试条会形成一个椭圆形抑菌圈，抑菌圈与测试条相交处的抗生素浓度示值即为MIC值。如果抑菌环与测试条交点位于两个示值之间，则读取高浓度的示值。当淋球菌沿试条生长即无椭圆形抑菌圈时，E-test值为大于最大浓度（>），当抑菌圈延伸至试条下方，与试条无交点时，E-test值为小于最小浓度（<）。如果抑菌环形状不规则或抑菌环不明显，导致无法读数，则试验结果无效。
记录结果时先记录参考菌株的MIC值，参考菌株MIC值在标准MIC值范围（表2-6）内或在标准MIC值±1个浓度梯度范围内表明本次试验有效；参考菌株MIC值超出上述范围则表明本次试验无效，需重新测定MIC值。待测菌株根据WHO西太区淋球菌抗菌药物敏感性的判断标准（表2-5）进行耐药结果判断。
5.结果报告
记录测试条上MIC值，以mg/L为单位，并根据耐药判定标准进行耐药（R）、中介（I）和敏感（S）结果报告。
6.临床意义
由于E-test梯度的稳定性与精确性，所测定的MIC值与琼脂稀释法比对后证实具有较好的重现性，在性病检测实验室中可以替代琼脂稀释法进行淋球菌药敏测定。
7.注意事项
（1）培养后培养基上要见到足够的菌落生长以及清晰的抑菌环边缘才可进行读数，菌落太稀少或有污染菌落不可进行读数。
（2）若两边交点的数值之差大于1个稀释度以上，则需重复试验。
（3）打开包装的E-test试纸条应存储在带干燥剂的密封容器中。
四、微量肉汤稀释法
1.检测原理
制备含有抗生素梯度浓度的微孔板，加入含有菌株的培养液，经适温培养后，以肉眼观察无细菌生长的微孔中所含的最低药物浓度为MIC。
2.检测准备
CO 2培养箱、麦氏管（McFarland管）、比浊仪或分光光度计、多通道加样器。含有梯度浓度抗生素的低温冷冻干燥微孔板、M-H肉汤（或GC肉汤、无菌生理盐水）。
3.标本采集
临床标本经选择性培养基分离培养后的纯菌落。
4.检测流程 （1）制备菌悬液：
刮取在非选择性培养基上生长18～20小时的培养物，在管壁上充分研磨混悬于1ml无菌生理盐水（或MH肉汤）中，用比浊仪调菌悬液浓度至0.5麦氏单位或用分光光度计调整OD 600至0.15左右（菌液浓度10 8CFU/ml）。再将菌悬液以1∶200加入M-H肉汤中稀释混匀，制备成5×10 5 CFU/ml的工作液备用。
（2）接种：
取100μl工作液加入每个微孔中（每孔液体总体积为100μl，总菌量为5×10 4CFU），注意设置空白对照。
（3）孵育：
将已接种的微孔板加盖放置于湿盒中，以防水分蒸发。在35～36℃、5%～10%CO 2条件下培养16～20小时后观察结果。
（4）结果判读：
读取无抗生素的对照孔，确定出现明显浑浊；读取无菌株的对照孔，确定液体澄清；然后从低浓度到高浓度逐一比较，以肉眼观察无菌生长孔作为MIC。
5.结果报告
能够抑制淋球菌生长的抗生素最低浓度即为该抗生素的最低抑菌浓度，记录MIC值，以mg/L为单位，并根据WHO淋球菌抗菌药物敏感性的判断标准（表2-5）进行耐药（R）、中介（I）和敏感（S）结果报告。
6.临床意义
肉汤稀释法快速简便，已广泛用于临床微生物的药敏检测，但淋球菌属于苛养菌，淋球菌药敏检测的肉汤稀释法还处于评估阶段，尚未有商品化检测试剂盒。
7.注意事项
（1）药敏微孔板应保存在-20℃，不可反复冻融，否则抗生素的活性会降低。
（2）微量稀释试验存在一个跳孔现象时应读最高的MIC，出现多个跳孔的药物时需重复测定，不可勉强判定。
（3）对于特殊菌株出现的药敏结果，建议通过琼脂稀释法进行结果复测。
（4）微孔板放置时，叠放不可超过5个。
（5）目前还没有淋球菌微量稀释法的判断标准，主要参考WHO琼脂稀释法的判断标准。
五、产青霉素酶的淋球菌的检测
淋球菌可通过质粒介导产生青霉素酶（β-内酰胺酶），使青霉素类抗生素失去活性，这一类淋球菌被称为产青霉素酶淋球菌（PPNG）。常用方法包括头孢硝噻吩显色法、碘量法或纸片酸度法等。
（一）头孢硝噻吩显色法 1.检测原理
其原理是β-内酰胺酶水解其结构上的β-内酰胺环，从而使头孢硝噻吩纸片（或滴有头孢硝噻吩水溶液的菌体）颜色由黄变红。
2.检测准备
头孢硝噻吩纸片（或水溶液），一次性接种环，滤纸/载玻片，空培养皿。
3.标本采集
临床标本经选择性培养基培养后长出的纯菌落。
4.检测流程 （1）头孢硝噻吩纸片法
1）将头孢硝噻吩纸片放置于空培养皿中，滴加无菌水湿润。
2）用一次性接种环刮取纯培养的新鲜菌落到纸片上。
3）1分钟后观察纸片颜色。
（2）头孢硝噻吩水溶液法
1）将头孢硝噻吩水溶液直接滴加到培养板的菌落上；或者先滴一滴头孢硝噻吩水溶液到滤纸/载玻片上，再用一次性接种环刮取纯培养的新鲜菌落于溶液中。
2）1分钟后观察菌落颜色。
（3）结果判读：
纸片或菌落变为红色为阳性反应，说明有β-内酰胺酶产生；纸片或菌落不变色，说明无β-内酰胺酶产生。根据上述纸片是否变色，判断是否为PPNG。
5.结果报告
（1）PPNG阳性。
（2）PPNG 阴性。
6.临床意义
青霉素已不用于我国淋病的治疗，PPNG的鉴定仅用于我国的淋球菌耐药监测项目。
7.注意事项
少数产青霉素酶的菌株变色反应较慢，可能会超过1分钟。
（二）碘量法 1.检测原理
β-内酰胺酶能裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸，它与淀粉竞争游离碘，破坏了碘和淀粉的蓝色复合物，使蓝色变为无色。
2.检测准备
（1）新鲜配制的碘溶液：150μl 100 000U/ml的青霉素溶液+1.1ml碘试剂（1.5mg碘化钾和0.3g碘，用100ml 0.1mol/L PBS溶解，棕色小管装好4℃保存）；4g/L的淀粉溶液。
（2）一次性接种环，滤纸/载玻片。
3.标本采集
临床标本经选择性培养基分离培养后的纯菌落。
4.检测流程
（1）于滤纸条上滴50μl新鲜配制的碘溶液，将一接种环培养物涂在碘溶液上；
（2）再滴加一滴4g/L的淀粉溶液；
（3）1～2分钟后观察颜色变化。
（4）结果判读：如蓝色变成无色即为β-内酰胺酶阳性，5分钟之内颜色无变化则为阴性。每次试验以WHO E株作阳性对照，A株作阴性对照。根据上述纸片是否变色，判断是否为PPNG。
5.结果报告
（1）PPNG 阳性。
（2）PPNG 阴性。
6.临床意义
同“头孢硝噻吩显色法”。
7.注意事项
（1）碘溶液需在试验前1小时内新鲜配制，其中碘试剂需避光保存。
（2）由于青霉素容易分解，配制的青霉素溶液可分装于试管中，在低温（-20℃）冰箱保存。
（3）淀粉液最好新鲜配制，贮存于冰箱不超过1周。
（4）少数产青霉素酶的菌株变色反应较慢，可能会超过1分钟。
（三）纸片酸度法 1.检测原理
β-内酰胺酶能裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸，使试剂pH降低，指示剂溴甲酚紫颜色由紫变黄。
2.检测准备
（1）青霉素溶液：100ml 0.05mol/L PBS（pH8.0）+0.2g溴甲酚紫+0.5g无缓冲剂的结晶青霉素。
（2）一次性接种环，滤纸，空白培养皿。
3.标本采集
临床标本经选择性培养基分离培养后的纯菌落。
4.检测流程
（1）将滤纸放置于空培养皿中，滴加上述青霉素溶液；
（2）将一接种环培养物涂在滤纸上，涂膜直径约5mm；
（3）盖好平皿，将滤纸片放置于室温孵育，半小时后观察颜色变化。
（4）结果判读：如蓝色变成黄色即为β-内酰胺酶阳性（一般在10分钟内能看到），颜色无变化则为阴性。每次试验以WHO E株作阳性对照，A株作阴性对照。根据上述纸片是否变色，判断是否为PPNG。
5.结果报告
（1）PPNG阳性。
（2）PPNG阴性。
6.临床意义
同“头孢硝噻吩显色法”。