二、光学显微镜技术

（一）普通光学显微镜

光学显微镜（light microscope）主要由机械部分、照明部分和光学部分三部分组成（图2-1）。机械部分是显微镜的支架，包括镜筒、镜柱、镜座、物镜转换器及调焦装置。光学显微镜是以日光为光源，其照明部分包括反光镜、聚光器及光阑，可对入射光线进行集光并调节其强弱。光学部分包括物镜和目镜，是光学放大系统，光镜的总放大倍数为物镜和目镜放大倍数的乘积，一般约1000倍，由于受光波衍射效应的限制，光镜的分辨率为0.2μm。

生物样品经过固定、包埋、切片和染色处理后才能观察到其微细结构。在光学显微镜下所见的结构，称为显微结构（microscopic structure）。

（二）荧光显微镜

荧光显微镜（fluorescence microscope）是以紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物质，产生能观察到的各种颜色荧光的一种光学显微镜，利用它可研究荧光物质在组织和细胞内的分布（图2-2）。

生物样标本中，某些细胞内的天然物质如叶绿素，经紫外线照射后能发出可见光线，即荧光（fluorescence），这种由细胞本身存在的物质经紫外线照射后发出的荧光称自发荧光。另一些细胞内成分经紫外线照射后不发荧光，但若用荧光染料进行活体染色或对固定后的切片进行染色，则在荧光显微镜下也能观察到荧光，这种荧光称诱发荧光。如吖啶橙能对细胞DNA和RNA同时染色，显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色，RNA呈红色。荧光染料和抗体能共价结合，被标记的抗体和相应的抗原结合形成抗原抗体复合物，经激发后发射荧光，可观察了解抗原在细胞内的分布。

与普通显微镜相比，荧光显微镜主要有以下特点：

（1）荧光显微镜一般采用弧光灯或高压汞灯作为紫外线发生的光源。

（2）使用互补滤光片——激发滤光片和阻断滤光片。①激发滤光片位于荧光光源和待测标本之间，产生短波的单色光激发标本发出荧光。②阻断滤光片位于目镜和标本之间，作用是阻断短波的激发光，只透过长波的荧光光线，以防伤害到观察者的眼睛。

（三）相差显微镜

普通光学显微镜观察染色的生物标本结构，主要是利用光线通过染色标本时其波长和振幅的差别来观察标本的微细结构。而活细胞和未经染色的生物标本，当光线通过时，光的波长和振幅变化不大，所以普通光学显微镜无法观察到。但光线在通过生物标本时除了波长和振幅的变化外，还有相位的差异，这种相位的差异，人眼无法分辨，只有将相位差转变成振幅差时，才能被人眼分辨出来。

相差显微镜（phase contrast microscope）是在普通光学显微镜基础上，分别在物镜后焦面上添加一个相差板、在聚光镜上增加一个环状光阑，将通过标本不同区域光波的光程差（相位差）转变为振幅差（明暗差），从而使活细胞或未经染色的标本内各种结构清晰可见。

观察活的培养细胞的结构常用倒置相差显微镜（inverted phase contrast microscope），与一般相差显微镜不同的是，它的光源和聚光镜装在载物台的上方，相差物镜在载物台的下方。利用这种装置可清楚地观察到贴附在培养瓶底上的细胞活动，如细胞分裂、细胞迁移运动等过程。

（四）暗视野显微镜

暗视野显微镜（dark field microscope）是利用暗视野聚光器代替普通光学显微镜上的聚光器或用中央遮光板遮去中央光束的照明法，使照明光线不能直接进入物镜，因而视野的背景是暗的，只有经过标本散射的光线才能进入物镜被放大，在黑暗背景中呈现明亮的图像。这种显微镜虽然对物体内部结构看不清，但却可以提高分辨率，能观察到0.004～0.2μm的微粒子的存在和运动。因此适合用来观察活细胞内某些细胞器如线粒体、细胞核以及液体介质中未染色的细菌、真菌、霉菌及血液中的白细胞等的运动。

（五）激光扫描共焦显微镜

激光扫描共焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）是20世纪80年代伴随计算机技术而发展起来的一种新型的显微镜。它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，应用激光激发荧光，得到细胞内部微细结构的荧光图像。激光扫描共聚焦显微镜利用特定波长的激光经照明针孔形成点光源，对标本内物镜焦平面上的一点照射，检测器仅仅收集来自该聚焦平面的荧光。这样，去除了荧光信号的互相干扰，分辨率较普通荧光显微镜提高约1.4倍，大大改善了成像质量。激光扫描共聚焦显微镜可毫无损伤地检测未经染色处理的活体组织细胞。

由于检测的焦平面厚度只有几百纳米，直径十几微米的细胞可被分成几十层分别成像，因此，又被称为细胞“CT”。分层扫描后的三维重建，有利于了解细胞的表面抗原、功能蛋白、细胞骨架、亚细胞结构的分布以及与功能的关系。这种三维的形态研究以及形态研究与代谢、功能研究的结合，是其他研究工具所不能比拟的。利用该技术可以观察细胞内Ca2+的分布、胞质中的细胞骨架纤维的网状结构、细胞核内染色体的排列等图像。