第二节 菌种的分离与复壮

一、培养基的制备

（一）培养基的类型

培养基的种类很多，为了研究方便，通常根据培养基的一些性质把它们分为不同的类型。

1．根据营养物质的来源不同来区分

（1）合成培养基 由已知化学成分及数量的化学药品配制而成。它适合于某些定量工作的研究，以减少不能控制的因素。此外，培养自养菌也是用成分简单的无机盐类配制的培养基。

（2）天然培养基 用天然物质或其浸出汁配制而成。肉汁、酵母浸出汁、麦芽汁、米曲汁、豆芽汁、马铃薯汁、麸皮等都是常用的天然营养原料，适合于培养许多异养型微生物。

（3）半合成培养基 由部分天然物质和一些成分已知的化学药品配制而成。

2．根据培养基的用途区分

（1）基础培养基 其组成物质能基本上满足一般微生物生长繁殖的需要。它的主要作用是促使微生物良好地生长。例如牛肉膏蛋白胨培养基，是适合于细菌培养的一种基础培养基；马铃薯葡萄糖培养基是适合于霉菌培养的基础培养基；麦芽汁培养基适合于酵母菌及霉菌培养；高氏一号培养基适合于放线菌的培养。

（2）富集培养基 由基础培养基加入某些特殊的营养物质，如血液、血清、酵母膏或其他生长因子而成，用以培养某些对营养要求较特殊的微生物。例如有些霉菌缺乏一种或数种氨基酸合成的能力，则培养时在马铃薯葡萄糖培养基中加入相应的氨基酸或适量的蛋白胨，就可使这些霉菌正常生长。

（3）选择培养基 它是根据微生物对某一化学物质的不同抗性或对某种营养物质的特殊需求而设计的培养基，常被用来分离某一种或某一类特定的微生物。例如含有青霉素或链霉素等抗生素的培养基，可以从混杂的微生物群体中，分离出霉菌或酵母菌；用纤维素为唯一碳源的培养基，可分离得到分解纤维素的微生物。

（4）鉴别培养基 主要用于菌种的鉴定。这种培养基中含有某些化学药品或指示剂，当某种微生物在该培养基中生长时，可表现出一种特殊的特征，使不同种类的微生物被区分开。

3．根据培养基的状态区分

根据培养基制成后的状态，可将培养基分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。它们之间的区别在于是否加有凝固剂以及凝固程度。可作为培养基凝固剂的物质主要有琼脂、明胶、硅胶等。琼脂是目前比较理想的凝固剂，它是从海藻中提取的一种多糖，不被绝大多数微生物所分解利用，具有较高的熔点（96℃以上），较低的凝固点（40℃），且对微生物没有毒性。固体培养基一般加琼脂1.5%～2.0%，半固体培养基一般加琼脂0.2%～0.7%，液体培养基中则不加凝固剂。用一些天然固形物作培养基时，也称为固体培养基。各种状态培养基的用途如下：

（1）固体培养基可以使所培养的微生物形成肉眼可见的菌落。在微生物分离、鉴定、计数和保藏等方面都采用这种培养基。

（2）半固体培养基在实验室中主要用来培养细菌，观察细菌的运动特性等。

（3）液体培养基容易使培养体系内的营养物质保持均匀状态，有利于微生物充分利用营养物质，积累代谢产物，所以在实验室和发酵工业生产中被广泛采用。

（二）制备培养基的一般原则

（1）所有微生物的培养基都应包含有碳源、氮源（有机氮、无机氮）、水及无机盐类，有些微生物生长还需要某种特殊的生长素。

（2）根据培养微生物的目的来选择合适的营养物。例如能利用纤维素的微生物在以葡萄糖为碳源的培养基中能正常生长；但如果是为了获得纤维素酶，则培养基中的碳源应该选用纤维素，以利于诱导细胞合成纤维素酶。

（3）在不影响培养效果的前提下，还应从经济、易得、配制方便等方面加以考虑选择培养基的营养物质。这方面，在配制工业发酵培养基时尤为重要。

（4）各种营养物质必须适量添加，合理配比。培养基中碳源和氮源的含量及比例对微生物的生长、代谢都有很大的影响。过高或过低的碳源和氮源含量都会抑制微生物的生长。在配制培养基时考虑更多的是碳源和氮源含量的比值，即C/N的问题。就一般菌体培养而言，细菌、酵母菌需要较多的氮素营养物，培养基的C/N在5∶1左右；霉菌则需要较多的碳素营养物，培养基的C/N在10∶1左右。对于工业发酵生产，则要通过调节培养基的C/N来控制微生物的代谢。各种矿质元素的含量，也要严格控制和均衡，某种单一元素含量过高，可影响其他矿质元素的吸收，甚至对细胞产生毒害作用。配制培养基时，通常选用一些多功能的无机盐提供矿质元素。例如将适量KH2PO4和Na2HPO4添加到培养基中不仅可作为微生物K、Na、P这三种矿质元素的来源，而且这两种盐还可作为缓冲剂，稳定培养基的酸碱度。

（5）各种微生物都有一定的生长pH范围和最适的生长pH。因此必须把培养基的pH调到微生物适宜生长范围。一般来说，细菌适宜于中性至偏碱性的环境，其生长的pH范围多在4～10，最适生长pH通常为7.0～7.5；酵母菌和霉菌适宜生长在偏酸性的环境中，其生长pH范围多在1～8，最适生长pH多为4.5～6。

（6）培养基的渗透压是由各种营养物质的浓度决定的。大多数微生物在正常营养物质浓度的渗透压下就能良好生长；但有的微生物的生长需要有较高的渗透压。为此，可额外加入一些糖或无机盐来调节渗透压。发酵工业上高浓度的营养基质有利于增加产量和提高设备的利用率，但过高的渗透压会抑制菌体生长，所以要根据生产菌的渗透压特性，来配制适当的营养物浓度的基质。

（三）培养基的制备方法

培养基种类很多，酿酒工业上培养霉菌及酵母菌一般均采用自然培养基。下面是几种酿酒常用培养基的配制方法。

1．米曲汁培养基的制备

将洗净的大米，常温下浸泡，将水滤去后，蒸米40min，取出加一定量的冷水，并将米粒搓散，再蒸，散冷后接种黄曲霉或米曲霉的三角瓶原菌，在保温箱中培养，待米粒变黄未生出孢子时，取出干燥备用；取米曲于4倍水中，于60℃糖化3～4h。用碘液试之不呈蓝色反应后，继续加热到90℃，过滤得米曲汁，备用；米曲汁加琼脂1.8%～2%，加热溶解后，分装于试管中，加棉塞，高压灭菌30min后放置成斜面，待其凝固后，在32℃保温箱中培养干燥5～7d，等试管壁上无凝结水，培养基上无杂菌后即可使用。在无菌条件下，向试管斜面培养基上接曲霉菌孢子少许，在32℃保温箱中培养6d，等孢子成熟后，检查有无杂菌，取出放在冰箱中备用。

2．葡萄糖豆芽汁培养基的制备

将黄豆用水冲洗干净，浸泡12～15h（夏季应注意换水1～2次），使黄豆吸水膨胀。然后倒去余水，放于瓷盘等容器内，上盖湿布，20～25℃保温，每天用温水冲洗1～2次，至芽长5cm左右时即可使用。黄豆发芽的另一个方法是将浸泡过的黄豆放在用水拌湿的锯木屑内，黄豆即可发芽生长。该法优点是生长过程中不需要管理，而且生长迅速。也可买市售的黄豆芽。洗净的黄豆芽100g，加水1000mL，煮沸40min，用纱布过滤，滤液用水补充至原来的体积（1000mL），即为10%的豆芽汁。如加入适量的葡萄糖，则为葡萄糖豆芽汁培养基。

3．麦芽汁培养基的制备

普通大麦浸泡1d，置于木制或草制筐内，面上盖1层湿布，保温20℃左右，每天冲水1～2次，至芽长为大麦本身的1倍时，即可风干，捣碎，制成大麦芽粉。也可买现成的麦芽。1kg大麦芽粉，加55～60℃温水4kg左右，在55～60℃水浴锅中保温糖化3～4h，至液体中加碘无淀粉反应为止（检查方法同米曲汁制备）。再用纱布过滤，装瓶加棉塞，并包扎油纸，0.1MPa蒸汽高压灭菌25～30min，杀菌后杂质沉淀，贮存备用。

麦芽汁制备的另一个方法是称取大米0.5kg，加水3～3.5kg，煮成稀饭，凉至60℃，加麦芽粉0.5kg，搅拌均匀，55～60℃保温，水浴锅糖化4～6h，过滤，所得滤液即为麦芽汁。其浓度约为13°Bx。这种方法一般在麦芽供应不足时采用。

4．葡萄糖马铃薯培养基制备

将马铃薯去皮切成薄片，切片后立即浸于水中，以免氧化变黑。每200g马铃薯加自来水1000mL，加热至80℃，热浸1h。用纱布过滤，滤液用水补足至1000mL，加入5%葡萄糖，搅拌溶解，即为葡萄糖马铃薯培养基。若马铃薯煮得过烂，则对菌生长不利。本培养基适用于根霉及产酯酵母的培养。如能以30%～40%的比例与麦芽汁或米曲汁混合使用则更好。

5．甜酒水培养基

将糯米淘洗干净，浸泡后蒸煮成饭，冷凉至30℃左右拌入根霉甜酒曲（不含酵母），装入清洁容器内，保温30℃培养1～2d后即成甜酒酿，煮沸后过滤，滤液即为甜酒水培养基。该培养基含葡萄糖较多，若制成固体培养基累代培养，将使霉菌糖化力和酵母发酵力下降，故多用于生产上作扩大培养时的三角瓶种子液用。

6．麸皮固体培养基

将较粗的麸皮加水70%～80%，充分拌匀，装入试管或三角瓶，装入量不宜过多或过少。然后用试管刷将附于试管壁上的麸皮刷干净，塞上棉塞，0.1MPa灭菌40min，即为麸皮固体培养基。该培养基应随做随用。

在上述培养液中，米曲汁、麦芽汁、甜酒水等浓度超过要求时，可加水稀释，加水量可按下列公式计算：

若需将上述培养液制成试管斜面固体培养基，应先将琼脂称好洗净，煮沸培养液，在沸腾状态下加入琼脂（琼脂用量一般为1.5%～2%），并不断搅拌直至完全融化为止；溶解加热时要注意火候，避免过热煳底烧焦及防止溢出。当琼脂溶化后，再加入热水补足所蒸发的水分（可事先做好标记），然后用两层纱布中间夹脱脂棉趁热过滤。若冬天气温低容易凝固，可用热滤漏斗过滤，过滤完毕，趁热进行分装，取大号玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下端连接一段橡皮管，管端与玻璃管嘴相接。橡皮管中间装一个弹簧止水夹，将整个装置安装在铁架上。分装时用左手夹住空试管的中部，将试管伸入漏斗下的试管内，以右手拇指及食指开放弹簧止水夹，使培养液流入试管内（图2-2）。注意不使培养基沾污试管上段管壁，以免沾污棉塞，引起杂菌污染。装入试管的培养基量视试管大小及需要而定。如用做保存菌种用的斜面，则装5mL左右（15mm×150mm试管），为试管长的1/5～1/4。如用做平板用的大试管（20mm×200mm规格试管），则装12～15mL。分装完毕，塞上棉塞。棉塞能过滤空气，避免污染。做棉塞要松紧合适，紧贴管壁不留缝隙，以防空气中杂菌沿缝隙侵入试管内。棉塞不宜过小，以免脱落，其2/3的长度应在试管内部，上部露出少许棉花，便于拔放（图2-3）。做棉塞用普通棉花即可。可在棉塞外加两层纱布包住，这样可延长使用时间。

做好棉塞，包扎好管口（图2-4），即可进行高压灭菌。然后趁热置于木棒上摆放适当的斜度，待冷却凝固后即成斜面培养基（图2-5）。

二、酿酒功能菌的分离

（一）酵母菌的分离

1．分离原理

在液体中，酵母菌的生长比霉菌快；酵母菌比细菌喜酸，适于酸性培养基；细菌对抗生素敏感，而酵母菌对抗生素不敏感。利用上述特性，可先降低大曲中的霉菌和细菌数量，使酵母菌占优势，再从中分离出酵母菌。

2．实验材料

固体曲，含0.5%乳酸的酸性麦芽汁培养基试管，固体链霉素麦芽汁琼脂培养基。

3．操作

可采用平板划线分离，也可采用稀释平板法分离。

（二）根霉的分离

大曲中的根霉一般呈菌丝和孢子状态，蔓延繁殖在曲块中，而曲块本身结合得较紧密，所以由大曲直接稀释分离往往得不到理想的结果。为了保证分离到根霉，一般先选择一种培养基进行预培养，待长出菌丝和孢子囊后，再进行稀释分离和纯化。

1．根霉的分离

用酒精消毒研钵，放入大曲研磨至细。取少许大曲粉撒在馒头上，在28℃下培养1～2d，待馒头上长出菌丝和孢子囊后，挑取有代表性的根霉，接种到豆芽汁葡萄糖斜面培养基上，28℃培养2～3d，长成孢子囊后进行纯化。

2．根霉的纯化

上述分离得到的根霉一般不是纯种，需要进一步纯化。

用接种针挑取一小丛带几个孢子囊的菌丝，放入装有10mL无菌水的第1试管中，打匀。再用接种环取1环至装有10mL无菌水的第2试管中，摇匀。由第2试管取1mL加入至第3试管（装有10mL无菌水）中。分别由第1试管、第2试管和第3试管中取0.5mL，接种到豆芽汁葡萄糖琼脂平板上。用玻璃刮刀刮平，28℃培养17～18h。最后，接出单菌落于豆芽汁葡萄糖斜面上。若不纯，则再进行纯化。

若有条件，应进行根霉鉴定。一般根霉只要从培养特征和形态观察即可确定到属。

（三）曲霉菌的分离培养

曲霉菌的分离，不必像根霉那样需进行预培养，可直接用稀释法进行分离；黄曲霉可用察氏培养基分离培养；黑曲霉可用马丁培养基分离培养。

在培养基中加入0.1%链霉素或结晶紫，可抑制细菌的生长。

（四）窖泥微生物的分离

1．窖泥中己酸菌的分离

己酸菌为嫌气芽孢杆菌，分离前应先把样品进行热处理，杀死其营养体和非芽孢杆菌，再采用厌氧培养，反复纯化，即可获得纯菌种。

富集培养基：乙醇25mL，乙酸钠8g，MgCl20.2g，NH4Cl 0.5g，MnSO40.0025g，CaSO40.01g，FeSO40.005g，Na2MoO40.0025g，生物素5μg，对氨基苯甲酸100μg，pH7.0的1mol磷酸二氢钾-磷酸氢二钠25mL，含1%的硫化钠和0.05%碳酸钠溶液20mL。加蒸馏水到975mL。除乙醇外的其他成分混合后灭菌，乙醇在使用前单独加入。

分离用培养基：KH2PO40.04%，MgSO4·7H2O 0.02%，CaCO31%，乙酸钠0.5%，硫酸铵0.05%，酵母膏0.1%，乙醇2%，pH7.0。除乙醇外的其他成分混合后灭菌，乙醇在使用前单独加入。

操作方法：取样品窖泥5g置于装有45mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡20min。静置5min后，逐级稀释成10-2、10-3、10-4、10-5不同浓度的菌悬液。取10-4～10-5浓度的菌悬液进行热处理（10min，80℃）。处理后的菌悬液用上述富集培养基培养7～8d至产气。然后挑取产气正常的试管转入新鲜富集培养液中培养7～10d。根据镜检及己酸显色反应结果，选取产己酸的富集培养试样。将试样富集液80℃热处理5min后，再用无菌水稀释至10-4～10-5，吸取不同浓度的稀释液进行平板分离，置于真空干燥器内（真空度80kPa），35℃培养5d。挑取分离良好的单菌落，转移到试管富集培养基中，在真空条件下培养7d，选取产气试管，测定产己酸的量，将产己酸高者进行镜检，观察菌体形态一致者，可作为初筛菌。在初筛菌株中，选取产己酸量较高的菌株编号，并反复进行纯化，在确认为纯种后，再进行鉴定、保存。

己酸菌的形态特征是：长杆菌，单个存在，菌体大小为（0.8～1.0）μm×（3.0～5.0）μm；在固体培养基上，30℃培养48h后，芽孢端生（芽孢发育开始为近端生），芽孢呈圆形、椭圆形或膨大为梭状，周生鞭毛，兼性厌气，革兰阴性，固体深层菌落灰白色，边缘整齐。

2．窖泥中丁酸菌的分离

丁酸菌的分离原理与己酸菌基本相同，但丁酸菌的分离、富集培养基与己酸菌不同。

所用培养基如下：

富集培养基：牛肉膏15g，蛋白胨20g，葡萄糖30g，碳酸钙20g，蒸馏水1000mL，pH7.0。

分离培养基：牛肉膏10g，葡萄糖50g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.0。

操作方法：分离时采用平板划线分离，平板置于真空干燥器内（真空度为80kPa），33～35℃培养3d后，单菌落接种于富集培养基中，培养到产气为止。

丁酸菌在显微镜下为鼓槌状芽孢杆菌，长3.0μm，宽0.8μm。用碘液染色呈蓝色，而己酸菌不呈色，可据此特性区分丁酸菌和己酸菌。

三、微生物的镜检、计数

（一）显微镜的使用

1．显微镜的构造

显微镜的构造见图2-6。

2．显微镜的使用方法

（1）观察前的准备

显微镜的放置：将镜箱打开，左手托住镜座，右手握住镜臂拿出显微镜，放于平稳的实验台上，镜座离实验台边3～4cm。镜检者姿态要端正，一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录，两眼必须同时睁开，以减少疲劳，也可练习左右眼均能观察。

调节光线：对光时应避免直接光源，若光线太强，反而看不清，强光还会损坏光源装置和镜头。如天气阴暗，可用日光灯或显微镜灯照明。调节光源时，首先将接物镜旋至镜筒下，旋转粗调节器，使镜头和载物台的距离为5mm左右，然后旋转聚光器螺旋，使它与载物台接近。再调节反光镜，在较强光下观察时，用平面的反光镜；光弱时用凹面镜。调整光圈，调节光线强度，直至照明效果最佳为止。电子显微镜以灯泡为光源，不用调节光线。可省去此环节。

（2）低倍镜观察 转动粗调节器，使接物镜向下移动，直至接近标本盖玻片的表面。用左眼看接目镜，慢慢旋转粗调节器。将镜筒上升至发现视野中的检查物后，改用细调节器，向上移动，尽量少向下移动。配合调节光线，能清楚地看到检查标本。移动载玻片标本，将所要观察的部位放在视野中心，进行观察计数或绘图。如果低倍镜看不清需放大，就转动转换器，用高倍物镜或换接目镜。

（3）高倍镜观察 转动转换器使高倍镜至标本盖玻片上，以细调节器校正焦点，再校正观察部位，并调节光圈，使检查物清晰可见。如果观察需要，也可换用油镜头。

最简捷的方法是 先用双眼从侧面注视物镜（高倍镜）和标本，直接用粗调节器将高倍接物镜调至非常接近标本盖玻片，再双眼注视目镜，用细调节器将物镜镜头慢慢上升直到标本图像清晰为止，移动载玻片，将所要观察的部位放在视野中心，进行观察记录。这种方法既快捷又不会损坏镜头。

（4）油镜观察 先滴一滴香柏油于盖玻片上，将油镜放正，缓缓调节调节器，将物镜镜筒下降。同时从侧面观察，使油镜头浸入油滴中，几乎与标本相接触。但切不可压及标本，以免有损于镜头。用左眼观察接目镜，向上微微调节粗调节器，当视野中出现有模糊被检物时，改用细调节器进行调节，直至清晰为止。同时调节光圈加强光线。油镜使用后，必须用擦镜纸擦去残留在镜头上的镜油，用擦镜纸沾少许二甲苯揩拭，然后再用擦镜纸擦干。

（5）显微镜使用完毕 用绸布擦净显微镜的金属部件，将各部分复原。反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。同时把聚光镜下降，以免接物镜与聚光镜发生碰接危险。

（二）镜检、计数

1．镜检

（1）斜面 先将载玻片和盖玻片从75%的酒精瓶中取出（平常不使用时，均将其保存在75%的酒精中），用滤纸及干净的纯棉（棉纱很细）手帕（专用手帕）擦干净，备用。

在超净工作台上，先在载玻片上滴一滴无菌水，再在无菌条件下用接种针勾很小一环菌落，均匀地涂在无菌水中，轻轻盖上盖玻片，置于显微镜下观察。

（2）液体 将载玻片和盖玻片从75%的酒精瓶中取出，用滤纸及干净的纯棉布擦干净，直接用毛细管取一滴菌液滴在载玻片上，轻轻盖下盖玻片，置于显微镜下观察。

2．显微镜直接计数法

（1）基本原理 利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（0.1mm3），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积中的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。

（2）血球计数板 通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上刻有一个方格，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。血球计数板构造如图2-7所示。

计数室的刻度一般有两种规格：一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格（图2-7）；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格（图2-8）。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25 ＝400小方格。每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2。

加上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1mL菌液中的总菌数。

计数室如图2-9所示。

（3）计算实例 以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算。

设：五个中方格中总菌数为144，菌液稀释倍数为6，那么，一个大方格中的总菌数（即0.1mm3中的总菌数）为（144÷5）×25，因1mL＝1cm3＝1000mm3，故1mL菌液中的总菌数＝（144÷5）×25×10×1000×6＝42750000个/mL，同理，如果是16个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为144，则1mL菌液中总菌数＝（144÷5）×16×10×1000×6 ＝23760000个/mL

（4）操作步骤 将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管（或毛细管）将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。

静置5min后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内有5～10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均值来计算样品的含菌量。

使用完毕后，将血球计数板在水龙头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

四、菌种复壮

（一）菌种退化的现象

1．在形态上

例如霉菌发生孢子减少甚至不生孢子，或霉丛色泽的明显变化等。

2．生理上

如霉菌淀粉酶活力下降，酵母生长缓慢及发酵力下降等.应该指出，若由于培养基的改变或因工艺条件的不当，以及污染杂菌等使菌种显示其性能低下的现象，则不能视为退化，因为这些暂时的外界原因一经消除，菌种原有的性能即可恢复。因此，必须识别所谓退化的假象，正确地判断菌种是否退化，以便采用适当的措施，加以防治。

（二）菌种退化的原因

菌种退化的主要原因是其基因的负突变，若控制生产性状的有关基因发生负突变，则可使菌种的生产性状严重劣化。例如控制产品产量的基因发生负突变，则会使产量下降；若控制霉菌孢子生成的基因发生负突变，则会使菌种产孢子的能力下降。

1．移殖代数的增加

一个经常处于旺盛生长状态的菌体细胞，发生基因负突变的几率，要比处于休眠状态的细胞大得多，而且在实际生产中，菌种的培养基及培养和发酵的条件是因批而异的，如果环境有利于负突变细胞增殖，则菌种的群体细胞经多次移植后，退化的细胞会很快占优势，使退化的性状明显起来。

2．菌种筛选方法不当

在菌种筛选中，往往在初筛时产量较高，但随着复筛的进行，则因产量逐步下降而被淘汰，这在霉菌筛选中更为多见。因为菌落若由一个以上的孢子或细胞繁殖而成，而其中只有一个高产的正突变孢子或细胞，则传代的结果必然是高产的菌体数量逐渐减少而使产量下降；若菌落确由一个孢子或细胞组成，但此菌为多核细胞，则在一次突变中几个核的变异状况各异，随着代数的增加，因核的分离会使菌体性状呈现多元化，产量也随之而变，即使为单核孢子，若在双链的DNA上只有一条链上的某个部位发生突变，则在不断的移殖过程中，也会产生性状分离而形成群体不纯，为尽可能地降低上述现象产生的几率，应采取得当的菌种选育手段。

3．培养及保存条件的影响

这种影响可由自发突变率来反映，也可在基因不变的情况下显示。在自发突变方面，例如培养或保存时间长，则对菌种的有毒害作用的成分积累较多而引起的突变率也较高。温度升高也会使菌株和突变率增加。培养基中某些成分的缺乏，也可促进野生型回复突变株的生长占据优势。

4．基因不产生突变而菌种退化的原因

例如某种曲霉若以分生孢子传代，则所产子囊孢子的数量逐渐减少。最终呈现不产子囊孢子的“突变”；但若用子囊孢子传代，则生成分子孢子的数量逐渐减少。这种状况下可用形成异核体的事实加以说明。若将黄色分生孢子的突变株，用子囊孢子多次传代，则可得到很少产分生孢子的黄色菌株；而将另一产生绿色分生孢子的野生株，多次以分生孢子传代，则可得到不产子囊孢子的绿色菌株，若将上述二株退化菌株装接于一起培养，则可得到1株既能产子囊孢子，又能产很多分生孢子的菌株，即表明形成了新的异核体。考察该异核体的分生孢子或子囊孢子重新分离的性状，若上述退化现象是由基因突变而造成的，则重新分离所得的黄色菌株，应产分生孢子很少，绿色菌株应不形成子囊孢子。但事实上分离的结果是这两个菌株均能产子囊孢子，且生成大量分生孢子，这表明上述退化性状并非由基因突变所致。这类退化现象的原因尚未十分明了。

（三）菌种退化的防治

（1）菌种选育要得法 例如加强分离纯化；使用单核菌株进行诱变；提高诱变剂量，使单核细胞DNA双链中的一条链有某一点位产生突变，而另一条则完全丧失作为模板复制的能力，以减少回复。

（2）防止基因自发突变 从菌种的培养基和培养条件方面加以注意。例如产麦芽糖酶能力强的酵母，用于白酒生产时出酒率较高；但若将其长期培养于葡萄糖培养基时，则产麦芽糖的能力会下降。若将其在液态麦芽汁中培养1～2代后，再接回到米曲汁试管斜面培养基上培养，则可有效地增强原有的能力。又如UV-11黑曲霉或UV-48黑曲霉菌株，采用察氏培养基培养时，开始几代长势良好，色泽正常，糖化力也可保持在5000～8000U；但继续传代后，相继呈现菌膜增厚，褶皱增大，孢子稀疏，色泽变淡及糖化力下降等现象。即使对其进行诱变和筛选，也无明显效果。但若采用下述固态试管斜面培养基，则可有效地防止这2种菌株的退化。即蔗糖3.0%，氯化钾0.05%，硝酸钠0.3%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，硫酸亚铁0.0001%，琼脂2%，蒸馏水85%～90%，麸皮浸出液10%～15%。不难理解，如果产生糖化酶能力强的曲霉等，长期生长于葡萄糖培养基上，则生成糖化酶的能力必然退化，因其可不必分泌糖化酶而可直接利用葡萄糖了。

（3）尽可能地减少传代次数 在每次转接生产用的菌种时，应保证满足一定生长期内的数量，以减少传代次数。霉菌不要用菌丝传代，而采用孢子传代，或交替使用分生孢子和子囊孢子传代，也可防止菌种退化。在一般条件下，斜面每移殖一代，酵母可保存三个月，霉菌、芽孢杆菌在低温下可保藏半年左右，无芽孢杆菌可保藏一个月左右。

（4）分离纯化 在生产过程中，菌种的许多细胞或孢子的变化趋势及程度是不可能相同的，大部分菌体可能随着时间的推移而某些性能发生相对的退化。但有些菌体的某些主要特性可能会增加，故应经常将后一部分菌体分离出来；或在试管原菌中，将优良的细胞菌体分离出来。由于菌落及试管原菌的不纯，有时还会污染杂菌，故定期进行单细胞分离纯化是完全必要的。

（5）消除退化的假象 例如在利用UV-11菌株制麸曲时，有的厂在工艺上忽视了它要求培养温度较低，不应超过32℃的特点，品温高达37～38℃.致使杂菌大量繁殖，但因曲表面有黄色掩盖而误为菌种退化。也有的厂片面地防止“水毛”，而忽视了UV-11要求水分偏高的特点，致使成曲孢子瘦小而色泽浅，萌发率低下，还有的不重视卫生和灭菌工作，在制曲过程中招致所谓白虮子的腐败菌的侵染，使成曲的糖化力很低，若缺乏理论知识和实际生产经验，而将诸如上述的种种假象视为菌种退化，则必然贻误生产的正常进行。

（四）菌种的复壮

菌种的优良性状的稳定是相对的，而变异是绝对的，生产上应用的菌种，在使用和保藏过程中，因外界条件和菌种内在因素的矛盾引起菌体的变异，可能发展到菌种的退化，发生某些形态和生理性能方面变化。如在斜面上发现黑曲霉孢子越传代越少和菌种残缺不齐等现象。酵母则发生细胞变形，生长缓慢或生产性能降低等，菌种的这种退化是由量变到质变的过程，当个体变异的数量达到一定程度时，菌种才能表现出退化现象。实践证明，传代次数越多，越易退化，因此在保藏菌种时尽量采取一些能够较长时间保藏的方法，避免经常转接，在退化现象出现后，要加以复壮，以恢复正常的生产性能。

既然菌种退化是在菌体退化细胞占相当数量后，所显示的生产性能下降的现象，则完全有可能采取相应的措施予以复壮。

1．分离纯化

将已退化的菌株用无菌生理盐水制成悬浊液，并放入装有无菌玻璃球的三角瓶中，放在摇床上振荡20～30min，利用玻璃球的滚动，使菌体细胞均匀分散。再按通常的稀释操作将菌液稀释至10-4～10-6，分别做平板培养。然后挑取若干典型菌落，接到试管斜面培养基上培养，并分别做发酵试验，从中选出优良菌株供生产用。因为自发突变使菌体退化是负突变，有时也会发生正突变，产生个别高产细胞，在复壮工作中获取好菌株的可能性是存在的。

2．用高剂量的U.V.和低剂量MNNG联合对退化菌株进行处理

以期得到发生正突变的优良菌株，或使负突变细胞回复。

（五）菌种的诱变

菌种的诱变是通过诱变剂处理提高菌种的突变几率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株。诱变育种和其他育种方法比较，具有速度快、收效大、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种重要方法。在生产中应用得十分普遍。但是诱发突变缺乏定向性，因此诱变突变必须与大规模的筛选工作相配合才能收到良好的效果。以下分别叙述诱变育种工作流程和诱变育种工作中的三个重要环节：突变的诱发、突变株的筛选、突变基因的表达。

1．诱变菌种的流程

出发菌种（沙土管或冷冻管）→斜面（或肉汤培养24h）→单孢子悬液（或细菌悬液）→诱变处理（处理前后的孢子液或细菌悬液活菌计数）→涂布平板→挑取单菌落传种斜面→摇瓶初筛→挑出高产斜面→留种保藏菌种→传种斜面→摇瓶复筛→挑出高产菌株做稳定性试验和菌种特性考察→放大试验罐中试验→大型投产试验。整个流程按诱变过程和筛选过程两部分说明如下：

（1）诱变过程 由出发菌种开始，制出新鲜孢子悬浮液（或细菌悬浮液）做诱变处理，然后以一定稀释度涂布平板，至平板上长出单菌落为止的各步骤为诱变过程。简述如下：

①菌种的斜面：出发菌种的斜面非常重要，其培养工艺最好是经过试验已知的最佳培养基和培养条件，要选取对诱变剂最敏感的斜面种龄，要求孢子数量适中。

②单孢子悬浮液制备。

③孢子计数：诱变处理前后的孢子悬液要孢子计数，以控制孢子悬液的孢子数和统计诱变致死率。常用于诱变处理的孢子悬液浓度为105～108个孢子/mL。孢子计数采用血球计数法在显微镜下直接计数。诱变致死率采用平板活菌计数来测定。

④单菌落分离：平皿内倾入20mL左右的培养基，凝固后，加入一定量经诱变处理的孢子液（以控制每一平皿生长10～50个菌落为合适的量），用刮棒涂布均匀后进行培养。

（2）筛选过程 诱变处理的孢子，经单菌落分离长出单菌落后，随机挑选单菌落进行生产能力测定，每一被挑选的单菌落传种斜面后，在模拟发酵工艺的摇瓶中培养，然后测定其生产能力，筛选过程主要包括传种斜面、菌株保藏和筛选高产菌株这三项工作。

诱变形成的高产菌株的数量往往小于筛选的实验误差，这是筛选工业生产菌株时常见的情况。因为真正的高产菌株，往往需要经过产量提高的逐步累积过程，才能变得越来越明显。所以有必要多挑选一些出发菌株进行多步育种，以确保挑选出高产菌株。反复诱变和筛选，将会提高筛选效率，可参考如下速度快、效果好的筛选步骤：①将出发菌株诱变处理；②平板分离200株单孢子菌株；③摇瓶初筛挑50株高产菌株；④摇瓶复筛挑5株高产菌株为下一轮的出发菌株；⑤将5株出发菌株诱变处理；⑥平板分离各出发菌株，各挑40菌株（共200株）；⑦再次采用初筛挑50株，复筛挑5株的同样方式进行诱变和筛选。

2．突变的诱发

突变的诱发受到菌种的遗传特性、诱变剂、菌种的生理状态以及诱变处理时环境条件的影响。

（1）出发菌株 出发菌株就是用来进行诱变试验的菌株。出发菌株的选择是诱变育种工作成败的关键。出发菌株的性能，如菌种的纯一性、菌种系谱、菌种的形态、生理、保存等特性，对诱变效果影响很大。挑选出发菌株有如下几点经验。①选择纯种作为出发菌株；②选择遗传特性好的菌株作为出发菌株；③选择对诱变剂敏感的菌株作为出发菌株。

（2）诱变剂的选择 选择诱变剂主要是根据已经成功的经验。诱变作用不但决定于诱变剂，还与出发菌株的遗传背景有关。一般对于遗传上不稳定的菌株，可采用温和的诱变剂。或采用已见效果的诱变剂；对于遗传上较稳定的菌株则采用强烈的、不常用的、诱变谱广的诱变剂。要重视出发菌株的诱变系谱。不要经常采用同一种诱变剂反复处理，以防止诱变效应饱和；但也不要频频变换诱变剂，以避免造成菌种的遗传背景复杂，不利于高产菌株的稳定。

选择诱变剂时，还应该考虑诱变剂本身的特点。例如紫外线主要作用于DNA分子的嘧啶碱基。而亚硝酸则主要作用于DNA分子嘌呤碱基。紫外线和亚硝酸复合使用，突变谱宽、诱变效果好。

关于诱变剂的最适剂量，有人主张采用致死率较高的剂量，例如采用90%～99.9%致死率的剂量，认为高剂量虽然负变株多，但变异幅度大；也有人主张采用中等剂量，例如致死率75%～80%或更低的剂量，认为这种剂量不会导致太多的负变株和形态突变株，因而高产菌株出现率较高。更为重要的是，采用低剂量诱变剂可能更有利于高产菌株的稳定。

（3）影响诱变效果的因素 除了出发菌株的遗传特性和诱变剂会影响诱变效果之外，菌种的生理状态、被处理菌株诱变前的预培养和诱变后的培养条件以及诱变处理时的外界条件等都会影响诱变效果。

菌种的生理状态与诱变效果有密切关系，例如碱基类似物、亚硝基胍（NTG）等只对分裂中的DNA有效，对静止的或休眠的孢子或细胞无效；而另外一些诱变剂，如紫外线、亚硝酸、烷化剂、电离辐射等能直接与DNA起反应，因此对静止的细胞也有诱变效应，但是对分裂中的细胞更有效。因此，放线菌、真菌的孢子在诱变前稍加萌发可以提高诱变率。

诱变处理前后的培养条件对诱变效果有明显的影响。可有意地于培养基中添加某些物质（如核酸碱基、咖啡因、氨基酸、氯化锂、重金属离子等）来影响细胞对DNA损伤的修复作用，使之出现更多的差错，而达到提高诱变率的目的。例如菌种在紫外线前，在富有核酸碱基的培养基中培养，能增加其对紫外线的敏感。相反，如果菌种在进行紫外线处理以前，培养于含有氯霉素（或缺乏色氨酸）的培养基中，则会降低突变率。紫外线诱变处理后，将孢子液分离于富有氨基酸的培养基中，则有利于菌种发生突变。

诱变率还受到其他外界条件，例如温度、氧气、pH、可见光等的影响。

3．突变株的筛选

菌体细胞经诱变剂处理后，要从大量的变异菌株中，把一些具有优良性状的突变株挑选出来，这需要有明确的筛选目标和筛选方法，需要进行认真细致的筛选工作，育种工作中常采用随机筛选和理性化筛选这两种筛选方法。

（1）随机筛选 随机筛选即菌种经诱变处理后，进行平板分离，随机挑选单菌落，从中筛选高产菌株。为了提高筛选效率，常采用下列方法：

①摇瓶筛选法：摇瓶筛选的优点是培养条件与生产培养条件相接近，但工作量大、时间长、操作复杂。

②琼脂块筛选法：这是一种简便、迅速的初筛方法。将单菌落连同其生长培养基（琼脂块）用打孔器取出，培养一段时间后，置于鉴定平板以测定其发酵产量。琼脂块筛选法的优点是操作简便、速度快。但是，固体培养条件和液体培养条件之间是有差异的，利用此法所取得的初筛结果，必须经摇瓶复筛验证。

③筛选自动化和筛选工具微型化：近年来，在研究筛选自动化方面有很大进展，筛选实验室实现了自动化和半自动化，大大提高了筛选效率。筛选工具的微型化也是很有意义的，例如将一些小瓶子取代现有的发酵摇瓶，在固定框架中振荡培养，可使操作简便，又可加大筛选量。但筛选工具微型化实验结果的准确性还有待提高。

（2）理性化筛选 理性化筛选是运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成发酵产物的高产突变株。

要使微生物大量地积累初级代谢产物，最重要的是需打破反馈抑制调节。降低终产物浓度和抗反馈突变的育种是打破反馈抵制调节的重要措施。

①降低终产物浓度：降低终产物浓度有两种方法可以达到此目的：A.选育终产物的营养缺陷型菌株，在培养基中供给限量的终产物使该菌株能生长，但不致造成反馈调节，因而积累大量中间代谢产物。B.筛选细胞膜透性改变的突变株，使之大量分泌终产物，以降低细胞内终产物浓度，从而避免终产物反馈调节。

②筛选抗反馈突变菌株

A.筛选结构类似物（抗代谢物）抗性突变株：分离抗反馈突变菌株最常用的方法是用与代谢产物结构类似的化合物（结构类似物）处理微生物细胞群体，杀死或抑制绝大多数菌体细胞，选出能大量产生该代谢物的抗反馈突变株。结构类似物一方面具有和代谢物相似的结构，因而具有和代谢物相似的反馈调节作用，阻碍该代谢物的生成；另一方面它不同于代谢物，不具有正常的生理功能，对菌体细胞的正常代谢有阻碍作用，会抑制菌的生长或导致菌的死亡。

B.利用回复突变筛选抗反馈突变菌株：经诱变处理出发菌株，先选出对产物敏感的营养缺陷型，再将营养缺陷型进行第二次诱变处理得到回复突变株。筛选的目的不是要获得完全回复原状的回复突变株，而是希望经过两次诱发突变，所得的回复突变株有可能改变了产物合成酶调节位点的氨基酸的顺序，使之不能和产物结合，因而不受产物的反馈抑制。

4．突变基因的表达

菌种的发酵产量决定于菌种的遗传特性和菌种的培养条件。突变株的遗传特性改变了，其培养条件也应该做出相应的改变。在菌种选育过程的每个阶段，都需不断改进培养基和培养条件。以鉴别带有新特点的突变株，寻找符合生产上某些特殊要求的菌株。高产菌株被筛选出来以后，要进行最佳发酵条件的研究，使高产基因能在生产规模条件下得以表现。

5．诱变育种实例

在白酒工业中广为应用的黑曲霉UV-11菌株及其进一步变异株，就是将野生菌株202经紫外线、钴60和亚硝基胍以及高能电子进行反复交替诱变而得到的。有人将台湾根霉R13-5连续地用紫外线及MNNG进行处理，得到了一株温度敏感型变异株，用麸皮为原料进行固态培养，其产糖化酶活力比亲株高5～7倍，若采用深层液态培养法，则酶活力比亲株高15倍。若以紫外线等因子处理白酒生产用的糖化菌，其变异可提高耐单宁及分解单宁的能力。

现以酵母菌株为例。

（1）平板分离培养基 酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，玫瑰红0.003%，丙酸0.19%，琼脂2%。

（2）原菌诱变 将原菌稀释培养于培养皿中，置于20W紫外灯下30cm处照射25s，能引起原菌较好的变异，挑取典型菌落进行发酵实验，最后选得2株菌种。

（3）驯化

①直接驯化：将上述2株菌种分别接入酒精度为6%～9%的麦芽汁培养基中，于30℃培养48h，比较酵母的存活率，反复转接至存活率相近。再经YPDI培养基平板分离，选出较理想的菌株。

②将浓醪发酵菌株继续驯化：将诱变所得2株菌种进行浓醪发酵，酒精浓度为13%，取该发酵醪少许，接入酒精浓度8%的麦芽汁中培养24h，经YPDI培养基分离，挑选若干典型菌落，进行3次发酵对比试验，最后得到2株较理想的菌株。