第三节 大曲中的微生物及酶类

一、大曲中微生物的来源

从大曲的制作到成曲的贮存管理，都是一个敞口开放作业的过程，所以微生物不难进入到大曲生产的全过程。归纳起来，大曲微生物的来源主要有空气、水、原料、器具和房屋环境等方面，而且一般规律为空气细菌多，原料霉菌多，场地酵母菌多。

1．空气

空气素有微生物的天然运输者之称。无论是土壤、水域、动植物之中的微生物，只要被卷入空气中就会被带到远离原地而落入其他诸如制曲场地的地方。所以可以看出，空气中的微生物在数量、品种上都较之任何一方多。但由于空气是流动性的，故而无法固定某种微生物长期在某个地方或空气中存留，同时又由于空气中缺乏营养物质和足够的水分，所以微生物在空气中不会有大量繁殖，特别是光照直射也不利于微生物的发育。显然空气仅作载体将微生物迎来送走，充当帮忙角色。

由于空气的流动受季节的影响，故空气中的微生物在数量和种类上也受季节的影响。如细菌冬天多于夏天，霉菌和酵母菌夏天多于冬天等。正因为有这一现象，才出现了大曲制“伏曲”、南方曲优于北方曲等制作的自然现象。

2．水

微生物在水中的数量取决于水质，因水源不同，其微生物的种类各不相同。天然水中的微生物以杆菌居多；土地水中所含微生物的品种和数量都较多，但仍以芽孢杆菌为主；地下水道的污水废物所含微生物以寄生菌和腐生菌为主。微生物之所以能在水中大量存在和生长繁殖，是因为水中有机物可作为其营养。

制曲时所使用的是自来水，即饮用水。据测定，1mL自来水平均含微生物96.3个，其中细菌就有95个，而霉菌只有1.3个。细菌中一般以大肠杆菌居多。由此可知，制曲用水的微生物含量和种类是有限的，在参与制大曲发酵过程中也以细菌行列加入，其作用是十分明显的。

3．原料

大曲所需的原料如大麦、小麦、豌豆、高粱等都是未经过任何化学的、物理的（高温、高压）处理而直接进入大曲制作现场的，可见其微生物含量之丰富。以小麦为例，每1g小麦含霉菌7.3×103个，酵母菌4.39×104个，细菌2.85×105个，其间包括空间网罗一些其他菌种。准确地说，原料是大曲微生物的主要来源，较之其他环节占优势。原料从在土壤中生长成熟，经晒去水分，到贮藏、运输等过程，都是在敞开的自然环境中进行的。原料上的微生物主要在其表面，个别的微生物可以侵入到原料内部，因而原料（粮食）上有“外部菌”、“内部菌”之分。就霉菌而言，对粮食是有害的，但对大曲发酵则有些是有益的。原料上霉菌的数量依次为曲霉、青霉、根霉、毛霉、镰刀菌等。酵母菌在原料上无多大危害，只有当原料霉变时，酵母菌才起进一步的危害作用，但带入大曲生产却是有益无害的。

4．器具

大曲的制作是敞口的，不但原料可以网罗空间微生物，而且用于大曲生产的器具也都可以网罗微生物，器具还另有储备“残留”微生物的特点。无论是机制还是人工踩制大曲，其所用器具或多或少地残留有曲料，这曲料好比菌种，会带入下次的制曲操作中，尽管可能带入下次的菌种是有害的，但都无可奈何地自然重复地交替作业。

器具微生物中不可忽视的是曲室和有些大曲生产所使用的糠壳、草帘或谷草物品。这两个环节的微生物不但品种数量多，且是经老熟驯化后的“精品”，也即优良菌。特别是使用糠壳、谷草物的大曲生产，如控制管理好的话，这些谷草物可以说是微生物菌种的“千年老窖万年糟”了。因栖息在其上的微生物或孢子不可能在每次更换谷草物中全部地换完，因而在发酵时将其覆盖在曲上时，完全起到了菌源无偿提供的作用，从而促进发酵向有益方向进行。

很难说明哪个微生物在大曲生产中起到“老大”的作用。实际情况是：发酵前期即低温培菌期时，细菌占绝对优势，其次为酵母菌，最后为霉菌。当发酵进入高温转化期时，细菌大量死亡，霉菌中的耐热菌种取而代之，又占强大的优势。所以，大曲的发酵过程是彼此交融的过程，兼容“互生、共生、抗生”的特色。事实上影响微生物生长的因素较多，除温度外，还有湿度、水分、pH、养料、氧等。因此，一般来讲，大曲生产过程中微生物的消长都包括“适应期、增殖期（繁殖期）、平衡期、衰老期”的“四期运动”。

适应期：低温培菌时微生物富集于曲坯，以逐渐适应其培养环境。由于水分和低温的因素，使得细胞体积增大，原生质均匀，贮藏物消耗，代谢开始，放出热量，即曲坯开始发酵。

增殖期：微生物代谢繁殖的强盛阶段。积累物质开始，产生的热量致使曲坯转入高温阶段。

平衡期：微生物耗尽营养，代谢产物积累达到顶点。此时，大曲水分挥发得太多而迫使微生物无条件生长和代谢。由于微生物不活动，故而大曲品温（曲坯温）开始下降，此时微生物细胞的原生质内开始积累贮备物质，绝大多数微生物在经过高温、耗尽养料后都以孢子的形式保存下来，当环境条件适应时重新生长繁殖。

衰老期：当耗尽养料后的微生物，其死亡的速度或数量远比新生的多时，就进入了衰老期。表现为活菌数少，代谢无力，放不出热量，曲坯品温再度降低，大曲进入老熟阶段。

二、大曲中微生物的分布

大曲的曲块一般分为两个层面，即表面层和曲心。从发酵阶段来看，由于好氧的关系，曲皮的菌高于里层和曲心。后期曲块水分挥发完全，曲心的菌类便开始生长了。发酵阶段大曲中的微生物分布情况见表2-3。

我们又从另一方面以微生物总数来观察其结果，见表2-4。

表2-3和表2-4都表明了两个现象：一是细菌数以及低温期的微生物总数始终占绝对优势；二是曲皮无论在哪个阶段其微生物总数多于曲心。这里对曲皮、曲心及大曲培养的定义是：曲皮为曲表面向内深度1cm的范围，其余为曲心。在低温期，曲坯的品温在40℃以内；在高温期，曲坯的品温在55～60℃。

成曲贮存期内微生物的变化见表2-5。

从表2-5可以看出，成曲贮存时间越长，细菌总数、酵母总菌数越少：反之霉菌增加。通过对大曲部位和贮存中微生物状况的了解，可知一般大曲贮存期以6个月为好，除微生物变化趋于稳定外，感官判别大曲的质量也最佳（生化性能另述）。

三、大曲中的酶系

酶是由微生物细胞产生的，具有蛋白质的有机催化剂。微生物的一切生命活动都离不开酶。在酿酒生产中大量培养各种微生物，主要就是利用它们能分泌所需要的酶。酶是在生物体内产生的，所以，也称为生物催化剂。

微生物体外大分子营养物质需由胞外酶分解成小分子化合物后，才能被微生物吸收。小分子化合物进入细胞后也要由酶来合成，从而释放能量，并获得中间产物，微生物利用这些中间产物和能量组成细胞内各成分，同时排出废物。这种新陈代谢是无数个复杂化学反应的过程，完全是在酶的催化下有条不紊地按顺序进行着，因此，也可以说，没有酶就没有生命。

1．酶的特性

（1）酶的催化效率高 酶的催化效率要比无机催化剂的催化效率高10万倍到1亿倍，它在细胞内温和的条件下，就能顺利地进行催化反应。例如固氮菌在常温、常压和近中性的条件下通过酶的催化作用就能固定大气中的分子氮，合成氨；而在工业上以化学方法合成氨时，虽然加有金属催化剂，也需要在20～30MPa压力和500℃的高温条件下才能进行。又如1g纯的结晶α-淀粉酶，在65℃下作用15min，可使2t淀粉转化为糊精。

（2）酶具有高度专一性 一种酶只能催化特定的一种或一类物质进行反应，并生成一定的物质。糖苷键、酯键、肽键的化合物都能用酸或碱来催化而水解，但酶的催化却各自需要一定专一酶才能水解。例如，淀粉酶只能催化淀粉的水解反应生成糊精；蛋白酶只能催化蛋白质的水解反应生成氨基酸；脂肪酶只能催化脂肪水解成脂肪酸和甘油。各种酶不能相互替代。由于酶催化的专一性，所以在酶的催化反应中没有副产品产生。酶的高度专一性还赋予细胞的生命活动能有条不紊地进行的能力。

（3）酶反应的条件极为缓和 利用化学催化剂时，往往要求高温，高压等条件，因而需要有高质量和较复杂的成套设备。酶在生物体内催化各种化学反应是在常温、常压和酸碱值差异不太大的条件下进行的。酶制剂具有反应条件缓和的特点，用于工业生产就可以甩掉高温、高压、强酸及强碱等特殊设备。如过去以酸水解淀粉生产葡萄糖，需要0.3MPa压力及144℃高温，必须采用耐酸耐压设备。现在改为酶法水解淀粉，只需常温、常压，采用普通设备即可。

（4）酶本身无毒，反应过程也不会产生有毒物质 酶是无毒、无味、无色的物质，在生产使用过程中也不产生腐蚀性物质和毒物，使医药、食品及发酵工业在生产过程中的劳动保护得到了改善，产品也符合卫生要求。

2．影响酶作用的因素

外界条件对微生物生命活动的影响，在很大程度上是通过影响酶的作用来实现的。酶催化化学反应的能力，称为酶活力。实践证明，酶活力受温度、pH、抑制剂、激活剂，酶浓度和其他因素的影响，因此我们在培养微生物，利用它所产生的酶，及生产酶制剂或使用酶制剂时，就必须找出适当的条件，充分地发挥酶的催化能力。

（1）温度对酶作用的影响 温度对酶催化的反应有显著的影响：一方面酶的催化能力要在一定温度条件下才能表现出来，并且酶反应的速度也像其他化学反应一样，随温度的升高而加速；另一方面由于酶是一种蛋白质，所以它的作用又随着温度的升高容易变性失去活力。即在最适温度下，一般温度每升高10℃，酶的反应速度会相应地增加1～2倍。超过最适温度时，若温度再升高，酶活力开始丧失，反应速度随温度升高而迅速下降。因此，选择酶作用的最适温度很重要。各种酶都有它作用的最适温度，但它的范围不是固定的，而是取决于整个酶反应时间的长短。

不同类型酶的最适反应温度见表2-6。

可见，多数酶最适反应温度在40～60℃，在60～70℃的溶液中即受到很大的破坏。

（2）pH对酶作用的影响pH对酶的活力影响也很大，这是由于酶是由氨基酸组成的蛋白质所构成的。蛋白质是两性物质，所以酶在pH改变时，有的能成为阳离子，也有的能成为阴离子。但在一定范围内，即酶在活性最适pH范围内，酶分子既不向阳极移动，也不向阴极移动，这时酶活力最高。

各种酶都有它作用的最适pH，在这个pH条件下，酶活力最高，pH过高或过低都会影响酶活力与稳定性。几种酶的最适pH如表2-7所示。

可见，酶的来源和种类不同，它的最适pH范围也不同。例如胃蛋白酶最适pH为1.5，而碱性蛋白酶最适pH为11。

同一种微生物所产生的酶由于作用底物不同，酶的最适pH也不同。有时即使同一种酶作用于一底物，但由于浓度不同或温度不同，对酶的最适pH也有影响。

（3）酶浓度对反应速度的影响 在适宜条件下，酶反应的速度与酶的浓度成正比，酶浓度越高，反应速度越快。

在酿造工业上，为了获得较高的原料分解率或出酒率。首先必须在制曲过程中培养需要的微生物，并给予微生物必要的条件使之产生尽可能多的酶，从而为发酵过程中提高酶的浓度创造条件。

（4）基质浓度对酶反应速度的影响 在酶反应体系中，酶浓度为定值时，基质浓度不同，反应速度也不同。当基质浓度较低时，反应速度随基质浓度的增加而增大；基质浓度逐渐增加时，反应速度虽然增加，但程度不如浓度低时明显；当基质浓度相当大时，反应速度不会再增加。

在曲酒生产中，入窖淀粉浓度不宜过大。基质浓度超过一定值时，则不能充分糖化发酵，这就是增粮不增酒的根源所在。糖化时，多用曲也并不一定加速糖化和多生成糖，因为基质的吸附作用是有限度的。由此可见，“合理配料”的重要性。

（5）酶的激活剂和抑制剂 凡能促进酶的作用及提高酶的活力的物质称为酶的激活剂，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Cl-等离子对酶有激活作用。

凡使酶的催化作用减弱或受到抑制，甚至破坏的物质，称为酶的抑制剂。如Ag+、Hg+、Cu+、硫化物、生物碱及酶催化反应的产物本身都可引起抑制作用。

选择合适的激活剂参加酶反应，可以大大提高酶的催化效率。

20世纪80年代以前，人们仅仅局限于对大曲的糖化力、发酵力进行研究，为提高原料利用率做出了极大的贡献。目前的研究集中在大曲酒的质量与曲质密不可分的关系方面。随着酶工程研究进展，人们广泛开展了大曲中各种酶类的研究，深化了对大曲糖化力、发酵力和风味生成相关酶系的认识，更使广大酿酒工作者充分认识了大曲质量与酒质的内在机理和规律。

3．大曲中的糖化酶类

大曲中的糖化酶类表现为曲的糖化力和液化力。

（1）液化型淀粉酶 液化型淀粉酶又称为α-淀粉酶，淀粉1，4-糊精酶。大曲中液化酶的主要作用是将酒醅中淀粉水解为小分子的糊精。

大曲中α-淀粉酶的活性受酒醅酸度的影响较大。实验表明，酒醅中添加乳酸后，大曲液化力随pH的下降而降低。液化力的降低，必然影响淀粉的液化，削弱糖化酶的效力。大曲中的α-淀粉酶可被糊化后的淀粉吸附，但该吸附作用可被酸性蛋白酶解脱。

液化力的测定方法是用大曲水解可溶性淀粉，用碘作指示剂，测定颜色变化的时间。通常测定单位是g淀粉/g曲。

大曲液化力的高低与培曲温度有关。酱香型曲因培曲温度高液化力最低，清香型曲因培曲温度低而液化力最高。大曲在曲房发酵过程中，液化力是逐渐上升的。在贮存过程中，贮存时间延长，液化力逐渐下降。

（2）糖化型淀粉酶 糖化型淀粉酶俗称糖化酶，淀粉1，4-葡萄糖苷酶和淀粉1，6-葡萄糖苷酶。该酶从淀粉的非还原性末端开始作用。顺次水解α-D-1，4-葡萄糖苷键，将葡萄糖一个一个地水解下来。遇到支点时，先将α-D-1，6-葡萄糖苷键断开，再继续水解。该酶不能水解异麦芽糖，但能水解β-界限糊精。

大曲糖化力的测定是利用大曲将可溶性淀粉水解，然后测定葡萄糖的量。因此，该法测定的是包含α-淀粉酶活力的糖化力。研究发现，在大曲淀粉酶活力测定方法中用滤纸过滤对测定值无干扰。

金属离子对大曲中的糖化酶有抑制作用。研究发现，铁离子、锰离子、铅离子对大曲糖化酶几乎没有抑制作用。锌离子有轻微的抑制作用。汞离子、银离子在极低浓度下有极强的抑制作用。铜离子的抑制作用属竞争性抑制，可被增多的底物解除。氯、汞、苯甲酸抑制α-淀粉酶的活力，不影响葡萄糖淀粉酶的活力。

有研究认为，大曲中的淀粉酶类主要是β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。β-淀粉酶在大曲中的含量是否占有很重要的地位，尚有待于进一步的研究。

糖化酶的产生菌主要是根霉、黑曲霉、米曲霉及红曲霉等。大曲糖化力主要来源于根霉。

大曲糖化力的高低与培曲温度密切相关。培曲温度高的酱香型曲糖化力低，培曲温度低的清香型曲糖化力最高。兼香型的中、高温曲的糖化力也证明了这一结论。

糖化力在大曲培养的前3天最高，后下降，最后又上升。在贮存过程中，曲的糖化力呈下降趋势。

对四季曲糖化力的化验也说明大曲的糖化力与温度的上升成反比。

4．大曲中的酒化酶类

（1）酒化酶是大曲在酒醅发酵过程中表现出的产酒的酶类的总称。该类酶能将可发酵性糖转化为酒精。这类酶用测定大曲发酵力的方法来衡量。大曲中主要的发酵菌种是酵母。

（2）大曲发酵力的常用测定方法是失重法。但现行测定方法实际上是测量了细菌、酵母、霉菌三种菌有氧呼吸和无氧代谢产生的二氧化碳总量，不能真实反映出大曲发酵能力的大小。因此采用测定发酵终了的酒精含量来衡量发酵力较为合理。前法测定的单位为mLCO2/（g曲·72h），后者测定的单位是：酒精质量分数%。

有研究认为，用失重法测定时使用的培养基种类、体积、糖度、曲药接种量、发酵温度、时间等均影响到发酵力的测定。认为失重法的最佳条件为：用高粱粉作糖化液，糖度7°Bé，体积50mL，曲药接种量0.8%。培养温度30℃，时间72h。

（3）大曲发酵力的高低与培曲温度成反比。高温酱香型曲的发酵力最低，培曲温度偏低的凤香型曲的发酵力最高。在大曲培养过程中，前十五天发酵力是上升的，至十五天后发酵力开始下降。贮存过程中，发酵力随贮存时间的延长而降低。

（4）大曲的曲外层和曲心的酶系也有差异，曲外层的糖化力、液化力、发酵力分别比曲心高79.22%、146.67%、67.56%。曲心的出酒率比外层高，曲心酿出的酒的己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯均比曲外层要高。

5．大曲中的酯酶

（1）酯酶亦称羧基酯酶，它是催化合成低级脂肪酸酯的酶类的总称。该酶既能催化酯的合成，也能催化酯的分解。因此，白酒业习惯分别称为酯化酶和酯分解酶。酵母、霉菌、细菌中均含有酯酶。目前已经发现，红曲霉、根霉中许多菌株有较强的己酸乙酯合成能力。

（2）酯酶不同于脂肪酶。脂肪酶的正式名称是甘油酯水解酶。它既能将脂肪水解为脂肪酸和甘油，又能催化脂肪的合成。

按诺维信公司的定义，脂肪酶是可以水解一类特殊的酯类——三羧酸甘油酯的酶，而酯酶则是可以水解羧酯键的酶。

（3）浓香型、清香型、凤香型等香型酒的香味成分与酒中的己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯等酯类的含量有关。这些酯的产生与酯酶密不可分。特别是对浓香型大曲酒的主体香己酸乙酯的研究表明，在大曲中添加酯化酶菌株或人工制造的酯化酶用于发酵，可极大地提高酒中己酸乙酯的含量。

脂肪酶对脂肪的分解，为白酒中香味物质（如油酸乙酯、亚油酸乙酯、棕榈酸乙酯等）的形成提供了前驱物质。

（4）大曲中酯化酶的测定主要是酯化力和酯分解率。酯化力是用曲粉去合成一定量的己酸和乙醇，最终测量己酸乙酯的生成量。酯分解率是用大曲分解己酸乙酯，测己酸乙酯的分解量。

由于测定方法上的差异，如用单一酸或混合酸，用离心法还是蒸馏法，对测定出的酯化酶活力影响较大。

（5）大曲酯化力的高低，与大曲发酵温度成反比，即发酵温度越高，曲的酯化力越低。兼香型中的中、高温曲的对比明显地证明了这一点。

酯分解率的高低与培菌温度相关，较低的温度有利于酯分解率的降低。事实上对浓香型酒而言，酯分解率越低越好，而酯化力则是越高越好。

大曲培养过程中，酯化率是先升高，至第5天时达最大值，后开始下降。培养至20d时，又达最大值，后再下降。变化比较复杂。而酯分解率的变化不大，基本上是逐渐上升的。

在大曲贮存期，曲的酯化力是随贮存时间的延长，前六个月处于上升阶段；六个月以后，逐渐下降。而酯分解率是随曲块贮存时间的延长而不断降低。因此，若仅考虑曲的酯化力和酯分解率，对浓香型曲酒而言，大曲贮存六个月使用最好。

6．大曲中的纤维素酶

纤维素酶是水解纤维素的一类酶的总称。它包括三种类型；即破坏天然纤维素晶状结构的C1酶，水解游离（直链）纤维素分子的CX酶和水解纤维素二糖的β-葡萄糖苷酶。作用顺序如下：

天然纤维素直链纤维素（游离）纤维二糖葡萄糖。纤维素酶的主要产生菌是里氏木霉菌、尖孢镰刀菌、粗糙脉胞霉等霉菌。

有研究认为，纤维素酶是广义β-葡聚糖酶的一种。

编号为EC.3.2.1.4的纤维素酶，其系统名是1，4-（1，3；1，4）-β-D-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶。它内切纤维素或由1，3和1，4键组成的多聚糖中的1，4键，将纤维素降解。

纤维素酶应用于白酒生产中，可提高白酒的出酒率，最高可提高9.05%。

目前为止，未见曲中纤维素酶的检测数据报道。白酒生产的酒醅中含有大量的纤维素和半纤维素。若提高曲中纤维素酶的含量，可大幅度提高出酒率。

纤维素酶的活力测定采用DINS法。分为滤纸酶活力（FPIA）和羧甲基纤维素酶活力（CMC）。FPIA为每克酶每分钟水解反应产生葡萄糖的微摩尔数。CMC法为每克酶每小时水解反应产生葡萄糖的质量（mg）。