骨髓的采集与转送必须由专人负责，严格核对。骨髓采集在无菌室内进行，严格按照国家执业医师实践技能考试所规定的骨髓穿刺术规范化标准进行操作，采集的器具必须为一次性。骨髓抽取量为50～150ml，所获细胞计数不低于2×10 ⁷/ml。

细胞制备过程必须严格无菌操作，操作步骤必须规范化和标准化，按中国 《药品生产质量管理规范》 ^[37]要求严格进行设施与制备质量管理；制备细胞的试剂、材料与辅料必须符合现行 《中华人民共和国药典》 ^[38]、《中国生物制品主要原辅材料质控标准》 ^[39]和 《一次性使用无菌医疗器械监督管理办法(暂行)》 ^[40]的要求；未纳入上述标准的化学试剂，应不低于化学纯。实验室和实验设备如前所述，必须达到我国卫生计生委(原卫生部)和国家食品药品监督管理局干细胞临床研究和应用规范整顿工作领导小组规定的条件 ^[21]。

分离骨髓MSCs的常用方法有密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和全骨髓贴壁培养法3种。具体如下。

通过介质和离心力场的作用使细胞分层并分离，可排除红细胞对间充质干细胞贴壁的影响，获得的细胞纯度较高，缺点是对间充质干细生长的骨髓微环境破坏较大，此外细胞流失较多。

通过MSCs表面带有或缺失的抗原成分，进行正选或负选而获得纯度较高的细胞，但可能在一定程度上影响细胞活性，费用也较高。

利用骨髓MSCs贴壁生长的特性，通过换液逐步去除漂浮生长的血细胞和造血干细胞以得到较纯的MSCs，并保留了骨髓中的促黏附物质和有利于骨髓MSCs生长的细胞因子，细胞增殖快、数量多，传代后纯化程度与前两种方法相似。综合考虑各方面因素，推荐首选全骨髓贴壁培养法。

骨髓MSCs分离、培养和扩增后，要根据细胞计数结果绘制细胞生长曲线图。制备的细胞以肝素生理盐水稀释至所需容量，计数细胞总数，以台盼蓝排斥法测定细胞活力，进行内毒素检验。用流式细胞仪鉴定骨髓干细胞成分，MSCs应CD105、CD90和CD73表达阳性，CD34、CD45或CD11b、CD79或CD19、HLA-DR表达阴性。

用于治疗的骨髓MSCs密度不应低于1×10 ⁸/ml。制备的细胞在4℃冰箱保存的时间不应超过6小时。

干细胞移植途径主要有经静脉、经心外膜心肌局部多点注射、经心内膜心肌局部多点注射及经冠状动脉内移植，各有其优缺点。具体如下。

无创，操作便捷，但仅有小部分移植细胞能到达心肌损伤区，效果不稳定；移植细胞可能随血流到达其他器官引起不必要的血管新生。此途径目前除实验性研究外，在临床治疗心血管病实施干细胞移植时较少采用。

常与CABG同时实施，定位及操作明确而直接，移植效果可靠；但手术风险及创伤较大，点状注射使细胞分布较为局限，易形成细胞孤岛，有可能诱发心律失常。

不需要开胸，但需采用特殊注射装置(如美国NOGA装置)。行左室造影，用导管上的多点细针将移植细胞高压注入梗死周边区域和其他兴趣区域。细胞密度一般采用(1～1.2)　×10 ⁸/ml，最大密度为2×10 ⁸/ml，用10ml肝素生理盐水制成细胞悬液。注射点数、每点细胞量和注射深度视具体情况决定，注射点通常为4～10点，细胞悬液量范围为10～50ml，注射深度范围为2～4mm。此途径疗效较好，但操作难度较大，同时也存在着移植细胞死亡、心肌水肿、心脏穿孔和发生心律失常的可能性。

经冠状动脉送入over-the-wire球囊，低压扩张球囊防止细胞输注时发生逆流，同时用高压将细胞注入病变远段血管内；通常输注3次，每次时间为2～3分钟；球囊扩张与细胞输注同步，以求干细胞能较多地进入心脏组织。细胞密度范围为(1～2)　×10 ⁸/ml，用15ml肝素生理盐水制成细胞悬液。目前大多数研究认为采用此方法效果相对最佳，可见患者心功能有较明显的改善。但仍存在细胞流失与分布较散，细胞归巢较差等问题。

建议采用冠脉内移植途径，有条件的单位可优选NOGA系统经心内膜注射途径。鼓励有条件的单位积极探索静脉途径干细胞对心肌组织发生特异性靶向归巢的有效方法。