第三节　脑胶质瘤的移植模型

胶质瘤的移植动物模型是指把人类或动物来源的胶质瘤细胞或组织接种到动物体内，从而在动物体内产生胶质瘤。移植模型根据肿瘤供体动物与受体动物之间的种系差异性，可分为同种移植模型和异种移植模型两类；按照接种部位不同，又可分为原位（颅内）和异位（皮下）移植两种。相对于原位移植，异位移植由于移植瘤的异位生长，其生物学行为不同于原位生长的脑胶质瘤，对研究胶质瘤的颅内生长特性及疗效治疗研究存在一定缺陷及限制，因此脑胶质瘤的原位移植动物模型在研究中更被广泛采纳。与自发肿瘤模型相比，虽然移植肿瘤模型缺乏如自发肿瘤形成时发生的渐变的遗传学改变过程，但由于其可在短期内成瘤，在评估新治疗方法疗效的研究中应用最为广泛。

一、胶质瘤的同种移植动物模型

同种移植是指肿瘤组织或细胞的移植发生在同种或同系动物之间。同种移植模型中由于受体动物对同源的供体肿瘤细胞不发生免疫排斥反应，比较适合应用于免疫治疗疗效研究。如大鼠的9L/Fisher344和小鼠的GL261/C57BL/6颅内荷瘤胶质瘤模型，分别是由大鼠胶质瘤细胞系9L颅内接种于Fisher344大鼠，或小鼠细胞系GL261颅内接种于C57BL/6小鼠而获得。其中，GL261来源于化学致癌剂诱导的C57BL/6胶质瘤模型，同种移植的GL261/C57BL/6小鼠胶质瘤动物模型被认为是胶质瘤研究中的黄金标准模型。C6胶质瘤动物模型也是应用较为广泛的胶质瘤模型之一，虽然C6胶质瘤细胞系来源于化学致癌剂N-甲基亚硝基脲诱导的Wistar大鼠，但由于Wistar大鼠为远交系动物，因此即便将C6接种于Wistar大鼠，此肿瘤也是具有免疫原性的，移植的肿瘤具有自然消退的倾向。C6胶质瘤在Wistar大鼠和BDX大鼠中都具有免疫原性，所以在评价免疫治疗疗效时被认为是没有价值的，不适用于免疫治疗学研究。大、小鼠是建立同种移植瘤模型最常用动物。本章节将介绍8种大鼠的同种移植模型（C6、9L、T9、RG2（D74）、F98、CNS-1、BT4C、RT-2）和5种小鼠的同种移植模型（GL261、GL26、CT-2A、SMA-560、4C8）。另外，虽有报道小鼠胶质细胞系G422在不同免疫背景的小鼠中如：BALB/c小鼠（具有免疫活性）、裸鼠（T细胞相关免疫功能缺陷）和C3-KO小鼠（补体C3敲除小鼠，补体C3相关免疫功能缺陷），并没有自然消退现象，但查阅相关文献时发现利用G422胶质瘤细胞系的相关研究报道并不多，截至目前仅有零星几篇，故此章节中不再加以详述。

（一）大鼠胶质瘤同种移植模型

1.C6胶质瘤模型

来源及生物学特性：

C6胶质瘤模型是麻省总医院的Benda和Schmidek等分别于1968年和1971年，通过给远交系的Wistar大鼠，5mg/kg剂量，每周一次，长达8个月尾静脉注射MNU而获得。在大鼠出现神经症状或全身状态不佳时，麻醉动物，摘除肿瘤组织并进行组织细胞培养。Benda（1968）将其中被称为6号的肿瘤组织行克隆培养后，将该细胞系命名为C6细胞，此细胞表达S-100蛋白。形态学表现为多形性、细胞核的形状亦多变。

C6胶质瘤细胞通常缺失p16/Cdkn2a/Ink4a基因位点，不表达p16和p19ARF的mRNA，野生型p53的表达亦缺失。与正常星形细胞比较，PDGFβ、IGF-1、EGFR和ERb3/Her3基因表达上调，FGF-9、FGF-10和IGF-2基因表达下调。这些表达差异与人类胶质瘤的表达谱相似。

应用：

由于C6胶质瘤细胞在组织形态学、遗传学及发生学上与人类胶质瘤的病程发展相似，所以大鼠的C6胶质瘤动物模型被广泛应用于神经肿瘤的各种治疗性实验中，包括化学治疗、抗血管生成治疗、蛋白酶抑制剂、毒素治疗、放疗、光疗、溶瘤病毒治疗和基因治疗等。然而，由于此肿瘤来源于远亲繁殖的Wistar大鼠，无同源宿主，所以在生存期研究中有很大局限甚至说是缺陷。此外，因为即使在Wistar大鼠中移植，该肿瘤也是具有免疫原性。C6胶质瘤在Wistar大鼠和BDX大鼠中都具有免疫原性，所以在评价免疫治疗疗效时被认为是没有价值的，因为免疫治疗效果多被放大。

C6胶质瘤细胞对所有近交系种属的大鼠而言都属于同种异体移植，应用C6胶质瘤动物模型进行研究时要充分避免由此带来的缺陷，尤其是不能将其应用于免疫治疗的研究。尽管如此，C6胶质瘤动物模型仍不失为一种很好的胶质瘤模型之一。C6胶质瘤细胞因其具有肿瘤干细胞样特性，在体外可以实现自我更新并具有多向分化潜能，在体内能够形成肿瘤。由此决定了C6胶质瘤动物模型在诸多研究领域，如脑胶质瘤的肿瘤生物学研究，包括肿瘤生长、侵袭、转移、血脑屏障破坏、新生血管形成等方面的研究，以及体内外各种实验性治疗研究中有着广泛的应用。

2.9L胶质肉瘤模型

来源及生物学特性：

9L大鼠胶质瘤细胞株最初由麻省总医院（Massachusetts General Hospital）的Benda和Schmidek于1971年获得，他们分别给鼠龄12周左右的C.D.Fischer 344大鼠每周一次5mg/kg的MNU静脉注射，持续26周，获得了数目不等的脑肿瘤模型。被Schmidek（1971）命名为“9号”的肿瘤，其分离培养得到的细胞，经加州大学脑肿瘤研究中心的Barker克隆后，被命名为“9L”细胞。由于此细胞株兼具胶质母细胞瘤和肉瘤形态特征，被重新命名为“9L胶质肉瘤”。

9L胶质肉瘤细胞在体内外均可快速扩增。颅内（i.c）接种于同种系的Fischer大鼠，可迅速生长成肿瘤，肿瘤由梭形细胞构成，具有肉瘤样特征，边界清晰，几乎没有肿瘤细胞侵袭入周边正常脑组织。Asai（1994）等报道，9L胶质肉瘤存在p53变异，但p16和p19ARF mRNAs表达正常。与大鼠干细胞来源的星形细胞相比，9L细胞的TGFα及其受体EGFR-1表达增加，FGF-2、FGF-9、FGFR-1和PDGFRβ表达下调。Ghods（2007）等，在9L细胞中观察到肿瘤干细胞样细胞（cancer stem-like cells，CSLCs）的存在。此类细胞可在特定培养基中呈神经球样生长，并表达神经干细胞标记物Nestin和Sox2，在体外具有自我更新和向神经元和胶质样细胞分化的能力。神经球生长速率较低，表达几种抗细胞凋亡和药物相关基因，这些细胞形成的肿瘤与其原始9L肿瘤相比具有更强的侵袭性。

应用：

9L胶质肉瘤模型用途广泛。如耐药机制研究，细胞动力学研究，药物通过血脑屏障和血脑肿瘤屏障的研究，脑肿瘤成像如MRI和PET等放射技术的研究和成像评估肿瘤缺氧和代谢的研究，亚硝基脲的药代动力学研究，抗血管生成药物的作用和机制研究，辐射作用研究等。此外，9L胶质肉瘤模型还被广泛应用于实验性治疗研究领域，如化疗、化疗、抗毒素治疗、细胞因子治疗、溶瘤病毒治疗、硼中子俘获疗法、血脑屏障破坏对化疗药物吸收作用研究和基因治疗等。

有学者指出9L胶质肉瘤具有很强的免疫原性，故在评估疗效时要充分考虑是否有免疫因素参与其中，治疗方法的实际疗效是否被放大。Blume（1974）报道，Fischer344大鼠用X-线照射过的9L细胞免疫接种后，会对再次接种的9L胶质肉瘤细胞发生抵抗，产生免疫；而未被事先免疫过的Fischer大鼠再次接种后则全部罹患了肿瘤，证实了9L胶质肉瘤即使对同源动物也具有免疫原性。这项研究最初在学术会议上发表，但当时并没有得到广泛关注，只是在后来的研究中，越来越多的学者发现并证实了这种模型的免疫原性，借此，9L胶质肉瘤动物模型具有免疫原性的特性才得以受到重视。9L胶质肉瘤细胞诱发免疫反应的机理被认为与细胞免疫相关。Asai（1994）等报道，在9L胶质肉瘤荷瘤Fischer344大鼠模型中再次后腿内注射9L细胞和脂质体包裹表达s-myc的质粒时，不但完全抑制了后续注入的肿瘤细胞的生长，大鼠原有的肿瘤亦逐渐缩小，且肿瘤组织内有大量CD8阳性T淋巴细胞和单核细胞浸润。作者通过一系列实验证实s-myc的表达可以刺激9L细胞肿瘤抗原提呈，从而激发T细胞介导的细胞免疫反应。现已证实，许多基因治疗的疗效在9L模型中被放大，原因就是在于治疗基因有可能激发了肿瘤相关免疫反应。如体内用HSV-tk/GCV自杀基因系统治疗9L胶质肉瘤，观察到的“旁观者效应”等，都与激发了宿主的免疫反应参与其中有一定关联。因此，有学者认为9L胶质肉瘤模型并不适合应用于基因治疗疗效的评价。而在评价其他治疗方法疗效时也要充分考虑是否有免疫反应参与其中，放大了真实疗效。如早期的研究中，单独用放疗或化疗或联合放疗化疗治疗9L胶质瘤大多没有获得成功，而用硼中子俘获治疗和基因治疗却获得成功。提示有可能是由于放疗或化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀伤了浸润于肿瘤组织中的免疫效应细胞，从而大大减少或消除了可能发生的与肿瘤相关的免疫反应。这可以部分解释为什么放疗和化疗在治疗9L胶质肉瘤中无效的原因。而硼中子俘获治疗和基因治疗有效，可能原因在于，这两种方法在杀伤肿瘤细胞的同时，又激发了浸润于肿瘤组织中的宿主免疫效应细胞发生免疫反应，清除了残存的肿瘤细胞，从而获得了较好的治疗效果。由于免疫放大效应的存在，极大地限制了9L模型在同源免疫活性大鼠中的应用，尤其是以生存期为目的的应用研究。

Stojiljkovic（2003）报道，尽管9L胶质肉瘤细胞源自于Fischer大鼠，但接种于Wistar大鼠颅内亦能形成肿瘤。免疫组化染色显示肿瘤细胞胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acid protein，GFAP）阴性，肿瘤组织内有活性型的ED1阳性巨噬细胞或小胶质细胞，肿块周围被大量的GFAP阳性的星形细胞环绕。此模型的肿瘤组织呈局限性生长，与周围组织边界清晰，为非浸润性生长模式，也不向蛛网膜下腔或脑室内播散。同时由于荷瘤鼠可以在没有任何神经症状情况下带瘤存活3周，此模型被认为可以用来评估以肿瘤消退为指标的治疗性实验疗效。Bhattacharya（2007）将此模型用于血脑屏障破坏及重复瘤内给药设备的植入和影像学的研究，取得较好效果。

此外，9L胶质肉瘤模型还被用来研发脑干肿瘤模型，以及制备耐药和浸润性复发的胶质瘤模型。Saito（2004）等利用9L细胞，获得了两个卡莫司汀[1，3-bis（2-chloroethyl）-1-nitrosourea，BCNU]耐药细胞株。将此两种细胞颅内移植，全部动物罹患肿瘤，比其亲本9L细胞更具侵袭性。尽管9L胶质肉瘤模型用途广泛，但在疗效研究中要充分考虑这一模型的高度免疫原性，谨慎得出结论。

3.T9胶质瘤模型

来源及生物学特性：

T9胶质瘤细胞曾一度甚至到现在也被认为是与9L胶质肉瘤相同的细胞株。最初由麻省总医院Sweet实验室的Denlinger（1972）和Koestner（1972）储存并提供，后又被两位学者重新命名为T9。T9的免疫原性与9L胶质肉瘤相同，也是具有高度的免疫原性。事先接受过T9细胞免疫接种的同源大鼠，再次颅内接种时不再形成肿瘤，而未被免疫组即使是低数量级的细胞接种也会形成肿瘤，证实了T9的免疫原性。

应用：

T9细胞株一经建立，被广泛用于各种研究，如抗血管生成、化疗药物、免疫疗法和白介素β基因治疗等疗效评估研究。但同9L一样，由于其免疫原性的存在，现已不建议将其应用于免疫治疗和基因治疗等可能引发肿瘤免疫的治疗性研究，以避免疗效被放大。

4.RG2（或D74）胶质瘤模型

来源及生物学特性：

RG2胶质瘤模型由俄亥俄州立大学Koestner实验室于1971年创立。CDF大鼠在怀孕20天时，静脉注射ENU（50mg/kg体重），诱发出神经肿瘤。Wechsler（1972，德国）将用此法获得的肿瘤组织克隆培养后命名为“RG2”（Rat glioma 2），而同一克隆在Koestner实验室又被称为“D74-RG2”或“D74”。镜下RG2胶质瘤细胞体积较正常胶质细胞小，形态均一、呈小梭形或星形，细胞核及核仁大、有丝分裂象明显，胞浆稀少，长纤维性突起使细胞以纵横交织方式生长。与正常大鼠星形细胞相比，遗传学特征表现为p16/Cdkn2a/Ink4a基因位点缺失，PDGFβ、IGF-1、Ras、Erb3/HER3的前体mRNA和cyclin D2的表达上调，PDGFβ的受体PDGFRβ表达下调。RG2胶质瘤具有高度侵袭性，被看作是复制胶质母细胞瘤的理想模型。

应用：

RG2胶质瘤模型被广泛用于一系列胶质瘤的临床前研究。如血管通透性改变的研究、血脑屏障破坏的研究、抗血管生成治疗研究、硼中子俘获治疗研究和放化疗研究等。此外，由于颅内RG2胶质瘤模型的血流动力学特点，还被认为是研究药物体内运输的理想模型。

野生型RG2胶质瘤对同源Fischer大鼠并不具有免疫原性。与C6和9L相比，RG2胶质瘤细胞的MHC I表达水平较低。然而，Oshiro（2001）等观察到，应用IFN-γ在体外处理RG2细胞，可以上调RG2胶质瘤细胞的MHC I的表达；体内颈动脉灌注可导致明显的抗肿瘤免疫反应，动物生存期延长，虽然此时肿瘤组织的MHC I表达并未增加，但ED2的表达则显示增多。这些研究结果提示，虽然野生型RG2对同源大鼠不具免疫原性，但外源因子的导入有可能使RG2细胞获得免疫原性，从而诱发同源宿主的免疫反应，因此RG2胶质瘤动物模型在应用于基因治疗疗效研究时，需要慎重评价其治疗效果，避免疗效被放大。尽管如此，由于RG2胶质瘤的浸润性生长模式和恶性度高、对各种治疗不敏感，以及对同源宿主的非免疫原性等特征，使其成为模拟人类胶质母细胞瘤的理想模型而被广泛应用。

5.F98胶质瘤模型

来源及生物学特性：

F98胶质瘤细胞株同RG2一样，来源于Koestner实验室。由Koestner和Wechsler于1971年建立，其制备方法同RG2。也是通过给孕期20天的CDF大鼠，静脉注射ENU（50mg/kg体重）诱发而成。组织学上显示为间变性或未分化的胶质瘤，细胞体积较RG2大，细胞呈极性生长，多由梭形细胞构成，少量多角形细胞，核大，胞浆少，突起较多但较RG2稍短，偶见有丝分裂象。与正常大鼠星形细胞相比，遗传学特征表现为p16/Cdkn2a/Ink4a基因位点缺失，过表达PDGFβ、Ras、EGFR、cyclin D1、cyclin D2和Rb，而PDGFβ的受体PDGFRβ表达下调。此外，低表达BRCA1、GFAP，波形蛋白表达阳性。由于该肿瘤与人类胶质母细胞瘤生物学行为相似，如高侵袭性的增长模式，低免疫原性，已被用于多种实验性治疗疗效研究。

应用：

人类高级别脑胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤预后差，传统放化疗并不能延长生命、改善预后。F98模型高度模拟人类胶质母细胞瘤，可用于人类胶质母细胞瘤新治疗方法的有效性评估实验。如：硼中子俘获疗法（BNCT）的疗效研究，同步加速器辐射结合CDDP（顺铂）化疗研究，放疗结合颅内顺铂化疗研究等。此外，基于F98颅内生长特点，该模型也可用于颅内胶质瘤的弥散张量成像影像学研究，在细胞水平上观察肿瘤微观结构和监测体内肿瘤的生长状况等。另外，该模型还被用来研究肿瘤血管生成和间充质干细胞的肿瘤趋向性研究等。

F98呈弱免疫原性。即使用编码B7.1共刺激分子的基因转染或用同源细胞疫苗结合粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF），仍不能增强其免疫原性。因而，F98模型被认为非常适用于胶质瘤免疫治疗耐受性发生机制研究，胶质母细胞瘤分子遗传学改变研究，药物在颅内肿瘤分布和基因治疗的研究等。同9L胶质肉瘤一样，F98细胞也可以用来制备脑干肿瘤动物模型，且由于肿瘤的组织病理学特征和放射生物学特征与人类原发脑干肿瘤极其相似，可被用来进行脑干胶质瘤的临床前治疗性试验研究等。

基因工程化F98胶质瘤模型的应用：

利用分子克隆技术在F98细胞中导入外源基因，可制备基因工程化的F98细胞及其基因工程化胶质瘤模型。如，F98细胞转染编码野生型表皮生长因子受体EGFR或EGFRvⅢ的表达载体，所产生的稳定表达EGFR或EGFRvⅢ的细胞系分别被命名为F98EGFR和F98npEGFRvⅢ。这两种细胞系中虽然有外源基因EGFR或EGFRvⅢ的表达，但由于表达的非功能性位点数目较少，还不足以诱发宿主的免疫反应。此两种模型已被用于中子俘获治疗研究和分子靶向治疗研究。此外，Bryant（2008）等将荧光素酶报告基因转入F98细胞，构建出F98-荧光素酶细胞系。将此细胞接种到Fisher大鼠颅内，可以通过活体荧光成像技术检测肿瘤组织大小，进行快速、无创性的肿瘤成像，用以评估新治疗方法的疗效。

其他：

有人将F98细胞接种于异种动物猫的颅内获得成功，被认为是拓宽了F98胶质瘤模型的应用范围。但由于异种移植能激发宿主的免疫排斥反应，所以该模型在神经肿瘤研究中的应用中必然也要受到一定程度的限制。

6.CNS-1胶质瘤模型

来源及生物学特性：

CNS-1胶质瘤细胞来源于近交系的Lewis大鼠，是通过每周静脉注射MNU，持续6个月而获得的中枢神经系统肿瘤。接种于Lewis大鼠颅内的肿瘤呈浸润性生长模式，在软脑膜、血管周围、侧脑室及脑室周围生长成瘤块并延伸入脉络丛，并沿着血管、脑室和蛛网膜下腔间隙向双侧大脑的远端迁移，同时肿瘤细胞呈单个弥散状向脑实质内播散。肿瘤细胞表达GFAP、波形蛋白vimentin和单核细胞趋化因子-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）。瘤块内肿瘤细胞排列成假栅栏样结构，但与人类胶质母细胞瘤相比范围较小。荷瘤动物通常致命于中枢神经系统的重要部位遭受侵袭，而非瘤块过大而导致。CNS-1肿瘤的播散性生长模式与人类胶质母细胞瘤极其相似，另外，与人类胶质母细胞瘤一样，CNS-1胶质瘤也被巨噬细胞和T细胞浸润，但不同的是并没有大量的血管内皮或微血管的增生。Kielian（2002）等发现CNS-1细胞结构性表达单核细胞趋化因子-1（MCP-1），并指出CNS-1表达MCP-1有可能在体内促使巨噬细胞趋化到肿瘤组织，但是否能够带来肿瘤的生长优势还不得而知。Platten（2003）等将稳定表达外源基因MCP-1的CNS-1接种于Lewis大鼠颅内，CNS-1肿瘤组织被小胶质细胞广泛浸润，并带来生长优势。

应用：

CNS-1呈弱免疫原性。CNS-1肿瘤组织的生物学特点及浸润性生长模式与人类胶质母细胞瘤多有相似。目前的应用有：胶质瘤的侵袭性研究，胶质瘤细胞的生物学变化和细胞外基质研究，基因治疗研究等。此外，该模型还被用于免疫治疗疗效研究，而免疫治疗被认为是人类胶质母细胞瘤潜在治疗手段之一。

7.BT4C胶质瘤模型

来源及生物学特性：

BT4C胶质瘤细胞来源于孕BD IX大鼠。亚硝基脲（ENU），75mg/kg体重，在孕18天时单次胎盘给药，在注射ENU 20~90小时后，分离BD IX胎鼠脑细胞，行体外连续培养，细胞经过一系列特征性表型变化和致瘤性转化（neoplastic transformation），经长达200天的培养，获得形成克隆的能力，逐渐成为具有致瘤性的细胞，简称“BT-细胞”。Laerum（1977）用此方法获得7株BT细胞，称为BT1C-BT7C，BT4C是其中一株。BT细胞株由胶质样细胞、扁平细胞混合而成，以胶质样细胞为主，偶见多倍体巨细胞。BT4C来源肿瘤，细胞密集，核不规则、大量的有丝分裂象，肿瘤血管不规则、在内皮细胞增殖区域显示膨胀和扩张。

应用：

BT4C模型已被用于化疗药物靶向治疗研究，抗肿瘤基因治疗研究，单独的抗血管生成和结合放疗及替莫唑胺的肿瘤治疗研究。另外，BT4C还被用于高浓度氧对荷瘤鼠作用研究，高浓度氧可以延缓肿瘤生长，促使肿瘤细胞的凋亡及微血管密度降低。除了用于上述疗效评价研究，BT4C胶质瘤模型还被用于化疗、放疗及自杀基因治疗引起的分子及生物学变化研究。此外，稳定表达报告基因β-半乳糖苷酶的BT4C胶质瘤细胞，还被用于体外肿瘤细胞迁移等研究。

8.RT-2胶质瘤模型

来源及生物学特性：

RT-2胶质瘤模型是由劳斯肉瘤病毒诱发的实验性脑肿瘤。最初是在犬类动物脑内获得，随后在大鼠和猴脑内也诱发成功。如，Copeland（1976）等用纯化的禽肉瘤病毒（avian sarcoma virus，ASV）悬浮液接种于C.D.Fischer 344大鼠颅内，接种后，鼠龄为1天和9天的大鼠2周内全部罹患神经系统肿瘤，经组织学鉴定，绝大多数为间变性星形细胞瘤，极少为低级别胶质瘤或肉瘤。

应用：

劳斯肉瘤病毒（ASV）直接诱导的RT-2胶质瘤模型已见于下述研究：①化疗研究：Mahaley（1977）等利用出生5天的Fischer 344大鼠颅内注射ASV诱发出RT-2胶质瘤，进行了化疗和化疗结合免疫治疗胶质瘤的研究。在研究中发现ASV诱导的RT-2胶质瘤表达病毒编码的肿瘤特异性抗原，具有免疫原性。②放疗研究：Steinbok（1979）等将ASV诱发的RT-2胶质瘤模型用于放疗和放疗结合化疗的研究，发现联合疗法优于单独疗法，但类固醇激素的应用会降低放疗疗效，可能原因在于类固醇类激素降低了肿瘤相关免疫反应的发生。③血脑屏障破坏及肿瘤渗透性（tumor permeability）的研究等。

ASV诱导的Fischer大鼠肿瘤细胞经培养传代形成的稳定的细胞系，被命名为RT-2胶质瘤细胞系。由RT-2胶质瘤细胞制备的胶质瘤模型已应用于：①抗血管生成和抗肿瘤作用研究：Tseng（2004）等利用RT-2胶质瘤模型研究白藜芦醇的抗肿瘤和抗血管生成作用，发现白藜芦醇能抑制肿瘤生长和肿瘤血管生成并延长胶质瘤荷瘤动物的生存期；②基因治疗研究：Tse（2004）的研究表明，野生型p53基因可以使RT-2胶质瘤荷瘤大鼠生存期延长，肿瘤体积缩小，VEGF和Tie-2的表达降低而促使肿瘤血管退化。Valerie（2001）研究了变异型自杀基因HSV-TK75对RT-2胶质瘤荷瘤鼠的作用，发现其疗效优于野生型；③放射增敏作用研究：Valerie（2001）等在研究中发现变异型自杀基因系统HSV-tk75转染的RT-2胶质瘤细胞较野生型转染的细胞对放疗更为敏感；④免疫治疗研究：Chen（2009）等用放射线照射过的RT-2胶质瘤细胞接种Fischer大鼠后，皮下再次接种野生型RT-2胶质瘤细胞，肿瘤呈较好生长状态，由此认为RT-2细胞的免疫原性较弱，不足以诱发较强的宿主抗肿瘤免疫反应。用137Cs放射源照射过的RT-2胶质瘤细胞（irradiated tumor vaccine，TV），粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）和白细胞介素-2（IL-2）治疗皮下或颅内RT-2荷瘤Fischer大鼠，发现单独应用TV，动物生存期未见延长，而联合应用以上三种方法或任何两种方法的联合治疗都可以使生存期延长，一方面证实RT-2胶质瘤细胞的弱免疫原性，另一方面提出虽然RT-2胶质瘤细胞免疫源性较弱，但持续的GM-CSF和IL-2刺激可以增强细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）和自然杀伤细胞（natural killer，NK）活性，产生抗肿瘤效应。提出以GM-CSF和IL-2为基础的免疫治疗为治疗胶质瘤提供了又一辅助治疗手段。Shah（2003）等提出RT-2肿瘤具有免疫原性，因为能激活CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。所以尽管Chen（2009）等提出RT-2的免疫原性还不足以引起宿主产生明显的抗肿瘤效应，但应用此类模型进行免疫治疗研究时还是要予以充分考量。虽然RT-2胶质瘤的内源性的免疫原性可能限制了它在免疫治疗及生存期等方面的研究，但在其他方向的研究上仍不失为有益的模型。

基因工程化RT-2胶质瘤模型的应用：

Mourad（2003）等将表达绿色荧光蛋白EGFP的基因工程化RT-2胶质母细胞瘤接种于同源Fisher大鼠细胞，制备出RT2-EGFP胶质母细胞瘤动物模型。他们发现可以利用EGFP的荧光特性，进行肿瘤细胞向周边组织侵袭和迁移的定量研究。Madara（2003）等将热休克蛋白72（heat shock protein 72，HSP72）转染入RT-2胶质瘤细胞，制备出HSP72基因工程化RT-2胶质瘤细胞。发现胶质瘤细胞内表达HSP72可使E1删除的溶瘤腺病毒在RT-2胶质瘤细胞内有效复制，从而达到溶瘤目的。为应用条件复制型溶瘤病毒治疗胶质瘤提供了新思路。

（二）小鼠胶质瘤同种移植模型

1.GL261胶质瘤模型

来源及生物学特性：

GL261胶质瘤模型是由C57BL/6小鼠颅内接种化学致癌剂甲基胆蒽诱发而成。最初是通过将小块肿瘤移植到同源小鼠的皮下或颅内的方法得以延续和保留。直到20世纪90年代中期，有数个实验室几乎在同一时期先后克隆出该肿瘤的细胞株，被称为GL261。目前，美国癌症研究所保留有GL261的冻存组织块，并同时通过接种于C57BL/6同源小鼠的方法延续保存该肿瘤。

GL261肿瘤组织在形态学上类似于室管膜母细胞瘤，但生物学行为更接近于胶质母细胞瘤，并表达胶质母细胞瘤标记物Vimentin。存在K-ras和p53基因变异，同时c-myc的表达增加。类似的基因改变也常在人类胶质母细胞瘤中发现。GL261肿瘤组织具有中等程度免疫原性，低表达MHC I，同时表达MHCⅡ、B7-1和B7-2。B7-1和B7-2为T细胞免疫共刺激分子。MHC和B7的表达下调，二者表达下调也是胶质母细胞瘤细胞株和CD133+脑肿瘤干细胞的特征之一，与免疫逃逸机制有关。

GL261接种形成的肿瘤具备许多胶质母细胞瘤特征，如肿瘤血管新生、坏死区域。组织学上细胞呈多形性，假栅栏样坏死和血管新生。虽呈浸润性生长，但并不发生转移，同时也未发现有肿瘤自然消退现象。GL261胶质瘤细胞还具有干细胞特性，体外无血清培养基中呈神经球样悬浮生长，表达干细胞标记物CD133，恢复血清培养，CD133表达转阴。这些特性与原代培养的人类胶质瘤母细胞瘤细胞极其相似。体内，由CD133阳性的胶质瘤细胞制备的C57BL/6同种移植模型，其移植瘤细胞呈多形性，瘤块内微血管密度高，肿瘤巢内浸润有各种免疫活性细胞，如巨噬细胞、树突状细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞等。Yi（2013）等将此模型与神经球样悬浮生长的人胶质母细胞瘤细胞接种的免疫缺陷鼠模型相比，发现GL261免疫活性鼠的同种移植比人胶母细胞瘤细胞免疫缺陷鼠的异种移植更具侵袭性和致瘤性，同时因伴有炎性细胞浸润等，在组织学上更加接近于人类胶质母细胞瘤的特征。由此，Yi（2013）等认为，在体内模拟胶质母细胞瘤的动物模型中，由神经球样生长的GL261细胞制备的C57BL/6免疫活性鼠模型要比神经球样生长的人胶质母细胞瘤细胞免疫缺陷鼠的异种移植模型更加可靠。

应用：

GL261是应用最多的具有免疫活性的小鼠移植瘤模型之一，应用范围也较为广泛。包括：①免疫治疗研究：免疫治疗是突破现有胶质母细胞瘤治疗方法瓶颈的新策略之一。GL261同源免疫活性鼠的异种移植模型是模拟人类胶质母细胞瘤的理想模型，被认为是研究神经胶质瘤的黄金标准模型。在免疫治疗研究领域，其应用也最为广泛。如输入T淋巴细胞的被动免疫治疗、抗体治疗、树突状细胞及肿瘤抗原疫苗治疗等。②基因治疗研究：Lichtor（1995）等利用转基因技术，发现IL-2和IFN-gamma两种基因的表达增加增强了GL261小鼠的抗肿瘤免疫，使肿瘤生长缓慢、生存期延长。③化疗研究：Kovacs（2014）等利用微泡增强聚焦超声技术（microbubble-enhanced focused ultrasound，MB-FUS）结合阿霉素治疗GL261和SMA-560的同种移植颅内荷瘤鼠，发现微泡增强聚焦超声技术可局部并可逆性地破坏GL261与SMA-560荷瘤鼠的血脑屏障，使血脑屏障具有渗透性，并有助于化疗药物阿霉素进入大脑，延长了GL261与SMA-560荷瘤鼠的生存期。④病毒治疗研究：Delta-24-RGD是一种肿瘤特异性溶瘤腺病毒，感染细胞后被感染的细胞可释放损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），DAMPs可被免疫活性细胞的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRR）识别，激活的PRR可诱导产生大量炎症前细胞因子如IFNs和IFNγ等，诱导相关抗肿瘤免疫反应的发生。此外，Delta-24-RGD还可诱导细胞自噬，裂解细胞。Jiang（2014）等将Delta-24-RGD原位注射到GL261的颅内C57BL/6荷瘤鼠，观察到免疫活性细胞的浸润，肿瘤体积的缩小和生存期的延长，证实了溶瘤病毒对颅内免疫活性鼠胶质瘤的治疗作用。

2.GL26胶质瘤模型

来源及生物学特性：

GL26胶质瘤的诱导方法同GL261，通过在C57BL/6小鼠颅内接种甲基胆蒽诱发而成。组织形态学亦类同于GL261，但较GL261更加接近于室管膜母细胞瘤样组织构成。与GL261相比有更多的坏死灶、血管更为丰富但并未见更多的出血灶。GL26肿瘤具有胶质母细胞瘤的特征，表达胶质母细胞瘤标记物Vimentin，细胞密度高，组织学特点包括细胞多形性、核非典型，伴有炎症细胞浸润。表达MHC I抗原，但MHCⅡ抗原阴性。无免疫原性。

应用：①免疫治疗研究：GL26胶质瘤模型最常应用于各种免疫治疗研究。由于GL26在同种移植中没有免疫原性，虽在应用上不及GL261广泛，但有证据显示在免疫治疗研究中是一个非常有价值的研究模型。GL26肿瘤表达黑色素瘤相关抗原（melanoma associated antigens，MAAs）“糖蛋白100”（gp100）和“酪氨酸酶相关蛋白2”（tyrosinaserelated protein 2，TRP-2）。有研究显示用MAA致敏的树突状细胞（DC）免疫接种GL26同种移植免疫活性小鼠，可诱导该荷瘤鼠产生强大的抗肿瘤免疫反应并明显延长其生存期。另有学者利用GL26肿瘤细胞裂解物致敏的表达IL-12的基因工程化DC细胞疫苗接种荷瘤GL26小鼠，产生同样的抗肿瘤效果。此外，还有学者利用CD25抗体PC61（CD25为调节性T细胞标记物）对颅内接种15天的荷瘤小鼠行瘤内注射，以耗竭GL26小鼠调节性T细胞（regulatory T lymphocytes，Treg），发现PC61可以抑制肿瘤生长，减少肿瘤组织中调节性T细胞的浸润并延长荷瘤小鼠生存期。②免疫治疗结合化疗研究：有些学者将化疗药替莫唑胺结合生存素基因修饰的DC免疫治疗可以延长荷瘤小鼠生存期。③肿瘤免疫机制研究：GL26模型还被用来进行肿瘤免疫逃逸机制研究。GL26胶质瘤组织高表达半乳糖凝集素-1（gal-1）mRNA。而gal-1在人类胶质瘤患者组织中的表达与胶质瘤的级别呈正相关，表达越多、患者预后越差。利用GL26的C57BL/6移植型模型，发现敲除gal-1基因，GL26丧失致瘤性，且致瘤性的丧失是由于gal-1对NK细胞的消除作用解除所致。

3.CT-2A胶质瘤模型

来源及生物学特性：

C57BL/6小鼠大脑皮层内注射化学致癌剂20-甲基胆蒽诱发而成的肿瘤简称CT。颅内接种甲基胆蒽450天后获得的肿瘤被命名为CT-2，而CT-2A是CT-2肿瘤经过同源小鼠连续的皮下移植传代过程中获得的变种，并由此建立了CT-2A细胞株。CT-2A胶质瘤模型恶性度高，瘤块质软，边界清晰，出血多见。组织学上具有高级别低分化间变性星形细胞瘤特点。细胞高度密集、异质性明显，细胞形态多样呈多形性，中心区假栅栏样坏死灶，肿瘤血管新生明显，肿瘤可沿血管向周边组织浸润。表达GFAP、Sox9和Sox10以及野生型p53，PTEN基因缺失。以上特点与人类胶质母细胞瘤颇为相似。用1×106肿瘤细胞/5μl颅内接种，肿瘤发生率达100%。

CT-2A胶质瘤细胞具有干性特征，无血清培养基培养，细胞悬浮生长呈神经球样，表达肿瘤干细胞标记物CD133及干性标记物Oct4、Nanog和Nestin。同时发现CT-2A细胞增殖速度要比人类胶母细胞瘤细胞U87快、侵袭性强，CT-2A神经球细胞的增殖速度和侵袭性更是远远超过CT-2A和U87。

应用：

①模拟人类胶质母细胞瘤和干细胞瘤：胶质瘤干细胞被认为是胶质瘤复发根源，与胶质瘤对放化疗的抵抗密切相关。由于CT-2A具有胶质母细胞瘤和干细胞的特性，使其在模拟免疫活性微环境下人类胶质母细胞瘤的各种治疗性实验中极具潜在应用价值，但其是否具有免疫原性还有待研究。②PTEN缺陷相关研究：PTEN与肿瘤的发生密切相关，而CT-2A胶质瘤缺乏PTEN基因，利用此特点可以进行PTEN缺失的相关研究。

4.SMA-560胶质瘤模型：

来源及生物学特性：

SMA-560胶质瘤是为数不多的发生在近交系小鼠的自发性颅内胶质瘤。Fraser于1971年曾报道在近交系VM小鼠发生的自发性颅内肿瘤为星形细胞瘤，但其致瘤性在体外组织块传代培养过程中逐渐丧失。Serano研究小组于1980年通过将VM自发星形细胞瘤连续移植后获得了胶质瘤的细胞株，被命名为SMA（spontaneous murine astrocytoma）。当时通过不同方式的传代移植共获得了5株细胞，P492、P496、P497、P540和P560。其中SMA-560与星形细胞瘤性质最为接近，并具有较强的致瘤性，5×104个细胞颅内接种，即可达到100%的致瘤率。同时，SMA-560胶质瘤还极具侵袭性，其侵袭性高于GL261。组织学上，SMA-560低表达S-100，高表达GFAP和谷氨酰胺合成酶，与星形细胞瘤表型相符。MHC I呈低表达，不表达MHCⅡ。此外，SMA-560肿瘤组织高分泌TGFβ，TGFβ为一种免疫抑制因子，通常在人类胶质母细胞瘤中呈高表达状态。另外，SMA-560细胞还具有干性特征，在神经干细胞培养基中呈球形悬浮生长，并对整合素抑制剂诱导的非典型细胞失巢凋亡有抵抗作用，而传统培养条件下整合素抑制剂可以诱导SMA-560胶质瘤细胞发生坏死和自噬。

应用：

SMA-560胶质瘤来源于自发肿瘤，与其他类型肿瘤相比更加接近于人类肿瘤的发生过程，譬如是在完整的免疫系统存在背景下，经历恶性度从低级到高级别的进程。因而SMA-560胶质瘤模型有望应用于各种治疗性实验及肿瘤发生机制研究。但由于还未见有商品化，研究较为局限。目前的应用还仅见于以下几方面：①免疫治疗研究：SMA-560胶质瘤模型多用于免疫治疗相关研究。如：Sampson（1997）等用白细胞介素IL-2和IL-4或肿瘤坏死因子TNFα转染SMA-560后颅内接种于VM/Dk小鼠，明显延长了其中位生存期；而经IL-3、IL-6、干扰素γ、粒-巨噬细胞集落刺激因子或共刺激分子B7.1（CD80）修饰的SMA-560接种后并不影响宿主生存期。Miller（2007）等用转染并高表达可溶性CD70的SMA-560颅内接种VM/Dk小鼠后，可见其肿瘤生长速度减慢、生存期延长，此作用可能是由于刺激了由宿主CD8+T细胞激发的抗肿瘤免疫反应所致。另外，SMA-560胶质瘤模型还被用来免疫疫苗研究，如Heimberger（2000）等用肿瘤匀浆致敏的DC接种VM小鼠后，颅内接种SMA-560胶质瘤，观察到小鼠的中位生存期明显延长。此外，Roth（2010）等还观察到利用TGFβ家族成员GDF-15（growth and differentiation factor）的shGDF-15增加了SMA-560荷瘤VM/Dk小鼠肿瘤组织中T细胞的浸润，中位生存期延长。②HPC介导的细胞治疗胶质瘤研究：Tabatabai（2010）等证实，用慢病毒转导造血祖细胞（hematopoietic progenitor cells，HPC）后，并不对转导HPC（Lenti-GFP-HPC）对胶质瘤的趋向性产生影响，同时证实该转导细胞不具有致瘤性，不改变SMA-560胶质瘤的生长和放疗效果。认为慢病毒修饰的HPC可用于胶质瘤的细胞治疗研究。

5.4C8胶质瘤模型

来源及生物学特性：

4C8胶质瘤细胞株来源于MBP/c-neu转基因小鼠的自发胶质瘤。Neu原癌基因是酪氨酸蛋白激酶家族成员之一，参与胶质细胞转化。MBP/c-neu转基因小鼠的自发脑肿瘤经组织学检查和免疫组化检测，与人类胶质母细胞瘤相符。从其中一肿瘤组织克隆培养出稳定的细胞株被称为MOCH-1，根据培养条件的不同，表现为星形细胞或少突胶质细胞特征。4C8是从MOCH-1克隆中获得的同质细胞群，颅内接种于具有免疫原性的同源B6D2F1小鼠，制备出的胶质瘤肿瘤组织具备如下特征：细胞密度高，假栅栏样坏死并呈浸润性生长，10%~20%的肿瘤细胞表达GFAP。这些组织学特征与人类胶质母细胞瘤相一致。同时表达MHC I和MHCⅡ抗原分子。B6D2F1小鼠颅内接种1×106个4C8肿瘤细胞，肿瘤体积在接种后34天即可达到100mm3，中位生存期为51天。以上特征表明4C8的B6D2F1颅内荷瘤鼠模型可适用于各种胶质瘤相关研究。

应用：

①抗血管生成药物联合抗肿瘤药物治疗胶质瘤研究：Lobo（2013）等利用4C8荷瘤B6D2F1小鼠，研究抗血管生成药物西地尼布（Cediranib）与奎纳克林（Quinacrine）对肿瘤生长的影响。发现二者联合应用可以有效抑制颅内肿瘤生长，延长荷瘤鼠中位生存期。肿瘤组织血流减少、血管通透性下降，平均血管密度降低，坏死增多。而任何一种单独使用时上述指标无明显变化，提示两种药物在抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤生长中具有协同作用。②脑肿瘤血管通透性和血流评估研究：4C8颅内同种移植模型新生血管丰富，与人类恶性胶质瘤特征一致，从而被认为适合用于胶质瘤的血管生成及血供等方面的研究。③免疫治疗研究：表达IL-12因子的单纯疱疹病毒瘤内注射具有显著抗肿瘤作用，可明显抑制肿瘤生长，促进免疫细胞瘤内浸润并且没有明显毒副作用。④潜在的基因治疗研究：Robert（2003）等发现阳离子脂质体-非编码质粒DNA复合物（EV-CLDC）对4C8颅内胶质瘤具有抑制肿瘤生长作用。其抑制作用可能与抗肿瘤血管生成和激发体内细胞免疫有关。如在非编码质粒中插入肿瘤抑制基因片段，有可能应用于基因治疗研究。

由于4C8建模相对较晚，其在胶质瘤研究领域的应用还有待开发，随着对其特性的深入了解，相信会逐步拓宽其适用范围。

二、胶质瘤的异种移植动物模型

虽然大、小鼠的脑胶质瘤同种移植模型为肿瘤发生学、影像学以及实验治疗学提供了有价值的资料，然而，每一种模型都有其局限性，要根据实验的性质选择合适的动物模型。譬如：C6、9L和T9等胶质瘤具有免疫原性，如果以研究生存时间延长或肿瘤治愈等为终点的研究，应用此类免疫活性鼠制备胶质瘤模型就不是一个好的选择。因为肿瘤内已有宿主免疫效应细胞的浸润，抗肿瘤效应会被明显扩大。

免疫缺陷动物问世以前，为了消除或避免受体动物对供体细胞或组织的免疫排斥反应，研究者们尝试各种方法以期抑制宿主免疫系统功能，造成免疫抑制或缺失：①将移植物接种于免疫缺陷区，如豚鼠眼前房，仓鼠颊囊，兔角膜及鸡胚绒毛膜等；②给受体动物照射X线或注射药物，如肾上腺皮质激素等，抑制受体动物的免疫功能；③采用抗淋巴血清，切除宿主胸腺等消除宿主免疫功能影响。上述模型由于制备方法复杂，虽有一定比例存活，但制作出的移植瘤生长缓慢，又受植入部位限制，空间有限，往往肿瘤组织块生长较小，难以适应尤其是治疗性实验研究所需，已极少采用。

直至20世纪60年代末，免疫缺陷动物的问世，才开始了真正意义上的脑肿瘤异种移植动物模型时代。免疫缺陷动物是指由于先天性遗传突变或人工诱导方法建立的一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物。移植模型就是利用免疫缺陷动物的特性，将人类或动物的胶质瘤细胞或组织接种到此类动物体内，从而制备相应的移植瘤模型。

免疫缺陷动物：

常用于脑胶质瘤模型制备的免疫缺陷动物有：①裸小鼠：先天性无胸腺。裸基因是一个隐性突变基因，位于11号染色体。通过遗传育种的方法将裸基因回交到不同的小鼠品系中，即导入不同的遗传背景。包括NIH-nu、BALB/c-nu、C3H-nu和C57BL/6-nu等；②裸大鼠（rnu）：与裸小鼠的特征基本相似，无胸腺、缺乏功能性T淋巴细胞，B细胞功能基本正常，NK细胞活力增强，抵抗力差，易患呼吸道疾病，裸大鼠同样能接受人类肿瘤的异体移植，同时由于其体型大，易于进行外科手术等，为脑肿瘤移植提供了便利；③SCID小鼠：T、B淋巴细胞缺乏和联合功能缺陷，对人类肿瘤移植成活率高于一般裸鼠，且肿瘤转移率高，其生物学行为如肿瘤的浸润、转移等与人类肿瘤的自发性转移极其相似。

异种移植的供体来源：

异种移植的供体为来源于不同种属的胶质瘤细胞和胶质瘤组织。主要有：①大鼠胶质瘤细胞系，如C6、9L、T9、RG2、F98、CS1-1、BT4C和RT-2等；②小鼠胶质瘤细胞系，如GL261、GL26、CT-2A、SMA-560和4C8等；③人类来源的各种胶质瘤细胞系如U87、U251等；④各种细胞系来源的胶质瘤干细胞；⑤人类原发胶质瘤肿瘤组织、培养的原代胶质瘤细胞或胶质瘤干细胞等。

应用人类胶质瘤细胞制备异种动物模型时要考虑以下几点：①许多人类胶质瘤细胞系在体外可扩增，但在体内并不具有侵袭性或致瘤性；②恶性度与移植瘤的移植成功率大致呈正相关，胶质母细胞瘤移植成功率最高；③人类胶质瘤细胞接种裸鼠后，可以表现为一个或几个肿瘤细胞亚群的选择性生长的特点，所以起源于同一原发瘤的瘤细胞在生物学性状上可表现出一定的异质性，经裸鼠传代培养，肿瘤细胞也可能表现出不同的基因型和表型；④人胶质瘤细胞的体外培养和扩增可能导致一些关键基因的改变，用原始人胶质母细胞肿瘤皮下或颅内接种代替体外培养可以克服这一缺陷，这些肿瘤在体内增殖后，发现可保留患者肿瘤组织活检的基因改变。

应用：

免疫缺陷动物的脑胶质瘤异种移植模型已经应用于胶质瘤领域的各项研究。包括：①胶质瘤发生机制研究：如胶质瘤增生和侵袭中各种信号通路分子和基质蛋白的作用及作用机制研究，可以较快评估某一分子在体内增殖和浸润中的作用；②新药筛选；③新型成像技术评估；④新治疗方法评估：如抗血管生成、化疗、放疗、免疫治疗、基因治疗及溶瘤病毒治疗等。

三、胶质瘤细胞株的种类

在移植瘤模型中，其供体多为各种来源的胶质瘤细胞。胶质瘤细胞系种类繁多，除可以用来制备胶质瘤的移植瘤模型，包括同种动物移植模型和异种动物移植模型（主要为免疫缺陷动物的异种模型）外，还可以利用转基因技术对胶质瘤细胞进行修饰后制备基因工程化胶质瘤细胞的动物移植。目前，仅美国菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC，又称美国模式菌种收集中心）提供的胶质瘤细胞株就有二十余种之多，主要为大鼠和人类种属来源的胶质瘤细胞。此外，ATCC还提供一些由不同克隆胶质瘤细胞系组成的细胞组群，如产品ATCC®TCP-1018TM，就是由5种胶质瘤细胞系构成，分别为CRL-1620TM（A172）、HTB-12TM（SW1088）、HTB-148TM（H4）、HTB-15TM（U-118MG）和HTB-14TM（U-87MG）。此组细胞群中每一株细胞都包含一种或是多种CDKN2A、PTEN和TP53的基因突变，遗传背景较为复杂，以适应相关研究需求。表2-1和表2-2对一些常用胶质瘤细胞株做一归纳。表2-1为大鼠胶质瘤细胞系，表2-2为人来源胶质瘤细胞系。近年来，人类胶质瘤细胞株有逐渐增多趋势。尽管如此，但要注意到相当一部分人类胶质瘤细胞株在体内并不具备致瘤性（表2-2），不能够用来制备胶质瘤动物模型，这在应用原代培养的胶质瘤细胞制备动物荷瘤模型时更应谨慎。表2-3给出了几种胶质瘤研究中常用的小鼠胶质瘤细胞系，供参考。

四、移植瘤模型的制备流程及检测手段

利用胶质瘤细胞或胶质瘤干细胞制备脑胶质瘤的移植瘤模型是比较成熟的技术，特别是细胞培养、精确的立体定向技术等技术进步，使移植变得不再复杂。其基本过程就是将人或动物的胶质瘤细胞（系）培养、浓缩制备成细胞悬液，然后接种到动物脑内或皮下。也有用人脑胶质瘤手术标本的组织块直接植入动物体内的方法。

（一）供体的选择及应用

移植瘤模型的供体有人类或动物的胶质瘤细胞系，或原代培养的胶质瘤细胞、胶质瘤干细胞，及来源于人类胶质瘤手术组织标本的组织块等。

（1）大鼠同种移植可供选择的细胞系：

C6、9L、T9、RG2（D74）、F98、BT4C、CNS-1和RT-2等。

（2）小鼠同种移植可供选择的细胞系：

GL261、GL26、CT-2A、SMA-560和4C8以及国内常用的G422等。

（3）小鼠异种移植可供选择的细胞系：

上述大、小鼠用于同种移植的细胞系和人类具有致瘤性的胶质瘤细胞系，以及原代培养的胶质瘤细胞或胶质瘤干细胞和胶质瘤手术组织等。

作为供体的肿瘤细胞要想在宿主体内存活并生长，必须要达到一定的数量和活力。以C6胶质瘤细胞为例，我们课题组在制备大、小鼠颅内胶质瘤模型时要求：①采集处于对数生长期的细胞，活力达到95%以上（台盼蓝染色活细胞计数）；②采集细胞和实验动物麻醉同步进行，从而保证移植前细胞处于最佳状态。实验动物未准备好之前细胞悬液可放置于0℃环境中（冰水中，与冰隔开），注射时混匀注入，也有采用将细胞悬液置于33℃恒温摇床的方法的报道。总之，要尽可能减少移入细胞活力的丧失；③细胞数及注射速度：大鼠细胞数为5×105，体积为5~10μl，缓慢注射，用时10min注射完毕；小鼠细胞数为1×105，体积为5μl，缓慢注射，用时20min注射完毕；④骨蜡封口。

（二）受体动物的选择

制备脑胶质瘤动物模型最常用的动物是鼠类。鼠在分子和生理上与人类具有广泛的相似性，是良好的肿瘤实验研究用工具。肿瘤在鼠体内的生长总是伴随着其他复杂的过程，例如血管生成和新陈代谢，这些过程与人类肿瘤的发展非常相似。更为重要的是，鼠肿瘤模型可为研究肿瘤的发生进程与治疗反应提供短期内的基因控制系统，如转基因鼠模型已广泛应用于恶性胶质瘤细胞起源的研究。同时，由于鼠胶质瘤拥有与人类恶性胶质瘤相似的分子亚型，鼠胶质瘤模型对临床前研究亦具有很高的价值，由基因组数据推测出的结论可以通过鼠类模型得到证实，如突变的起源、个体化治疗临床前期试验等。

目前，可供选择的大鼠有Wistar、SD、Fisher344、SHR、ACL、BDX等，小鼠有BALB/C、C57、NIH、ICR、SCID小鼠以及中国的昆明小鼠等。由于大鼠较之小鼠体重大，脑体积也大，制备脑胶质瘤模型操作、定位及注入肿瘤细胞更为容易，因而在应用上较小鼠广泛。近年来由于基因工程化细胞系的制备及运用增多，小鼠及裸鼠模型应用也逐渐增多。

大鼠多用于制备同种移植模型，这是因为大多数的动物胶质瘤细胞系都是在大鼠中诱发并分离培养的，如C6、9L、T9、RG2、F98、RT2、CNS-1等。小鼠的同种移植模型较之大鼠数量较少，而且商品化的细胞株更不多见。除同种移植模型外，小鼠最主要的用途还是应用于人类肿瘤细胞的异种移植，如人类胶质瘤细胞系U87、U251及原代培养的胶质瘤细胞或胶质瘤干细胞的移植等，以及转基因动物模型采用的也都是小鼠。此外，来源于大鼠的胶质瘤细胞系也可应用于小鼠（如裸鼠等免疫缺陷小鼠）制备异种移植模型。表2-4对大、小鼠各自的优缺点进行了总结。除鼠类模型外，大动物模型虽然受来源以及实验条件限制和经费制约，使用远不及大、小鼠普遍，但也有用猫、狗和猴等制备脑胶质瘤模型的零星报道。猫犬等大动物模型被认为是提供了介于啮齿类动物和人类之间的中间过渡形式。

（三）颅内胶质瘤动物模型进针部位和方式

颅内胶质瘤动物模型的制备目前广泛采用的是立体定向技术。定点、定量将胶质瘤细胞注射到动物颅内的固定区域，从而使制备的颅内胶质瘤动物模型重复性、稳定性和均一性得到有效控制和良好再现。目前小动物的立体定向仪使用较多的有德国产的KOPE 940数显单臂或双臂小动物立体定位仪，或美国的Stoelting全自动立体定位仪。配置大鼠或小鼠的耳杆和适配器等配件，即可有针对性地有效定位并控制大鼠或小鼠的颅内进针位置及注射部位。

大鼠颅内胶质瘤动物模型选择冠状缝前1mm，中线右旁开3mm处进针（图2-1）。此位置为右侧尾状核，选择此处植入细胞，可避开侧脑室一定距离，防止肿瘤细胞进入脑室系统，减少种植转移的发生。同样以C6胶质瘤模型为例，首先用颅骨钻钻一小孔，微量注射器取C6细胞悬液10μl（5×105细胞），沿骨孔缓慢垂直进针至硬脑膜下6mm，再回退1mm，注射速度为1μl/min，共注射10min，注射完毕后留针5min，拔针。骨孔用骨蜡封闭。缝合切口后消毒皮肤。小鼠选择接种于前囟前2.0mm，中线右侧2.5mm处。同样用颅钻钻孔至硬脑膜，用微量注射器取C6细胞悬液5μl（1×105细胞），沿骨孔垂直进入硬膜下4.0mm，后退1.0mm后，20min内缓慢匀速推进内芯，将细胞植入到鼠的右侧尾状核。缓慢拔针，骨蜡封闭骨孔，丝线缝合头皮后待其自然苏醒。选择进针后再回退的方式，可给予细胞种植预留空间，尽可能避免肿瘤细胞沿针道扩散。同时，骨蜡封口可以防止细胞液外溢。

（四）颅内胶质瘤影像学检测

影像学检测方法建立以前，脑胶质瘤原位移植的动物颅内是否成瘤多依赖观察动物的精神状态、饮食状况、体重及是否出现神经症状等进行判断，只有在肿瘤较大时才能被发现。直到20世纪90年代，影像学检测技术如MRI、CT等影像学检查手段的应用，才实现了无创伤、动态监测活体动物肿瘤的生长。近年来，分子影像学的发展更是为活体状态下进行特异性分子事件研究提供了可靠手段。

目前，实验动物的成像方法大体上可归纳为结构成像（解剖成像）和功能成像（分子成像）。传统的结构成像即为我们所熟知的CT、MRI及超声等成像技术；而功能成像即分子成像技术则是利用特异性分子探针追踪靶标并成像，如活体光学成像、小动物PET和小动物SPECT等，可以动态观察活体动物体内分子生物学过程。分子影像学（molecular imaging）概念，是1999年美国哈佛大学Weissleder（1999）等人提出的，是指应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究。事实上，传统的成像技术也可应用于分子成像，如MRI、PET等。

分子成像技术大体可分为光学成像、核素成像、磁共振成像、超声成像和CT成像五大类。主要应用于研究并观察特异性细胞、基因和分子的表达和相互作用过程，可同时检测多种分子事件，追踪靶细胞等。在肿瘤研究领域不仅可以用来动态监测肿瘤大小及转移情况，还可以在肿瘤药物研发中，通过标记物的追踪，直接活体观察药物对肿瘤是否具有靶向作用，并提供体内分布数据，为研究药物疗效和作用机制提供帮助。

此章节里我们仅就光学成像、PET和MRI这三种小动物颅内胶质瘤的常用检测方法做一简单介绍。

1.光学成像

活体动物体内光学成像主要采用生物发光（bioluminescence）和荧光发光（fluorescence）两种技术。生物发光是用荧光素酶（luciferase）标记，荧光发光则采用特定的荧光蛋白或外源性荧光基因进行标记。生物发光与荧光发光的区别在于，生物发光需要生物体内荧光素酶与外源性提供的各种荧光素酶底物发生化学反应而产生光信号；而荧光发光的荧光标记基因本身就是一个生物发光系统，无需底物或其他分子介导，在相应波长激发光照射下可直接发光。二者各有利弊。

生物发光的胶质瘤细胞的标记方法通常是通过分子克隆技术，将荧光素酶基因整合入胶质瘤细胞的染色体内，通过单克隆细胞技术筛选、培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。目前也有标记好的胶质瘤细胞株在售。将标记好的细胞注入小鼠体内后，观测前注射荧光素酶底物——荧光素。荧光素脂溶性好，易通过血脑屏障。然后应用小动物活体成像系统进行成像。

光学成像标记物可用来标记细胞、药物、基因及转基因动物模型等。笔者所在团队实验室引进的小动物活体成像设备（IVIS spectrum系统），即为光学成像系统。可检测到颅内肿瘤发光信号，并可进行三维立体结构重塑。由于颅内肿瘤生长特点，化学发光的荧光信号因穿透力稍差，不易穿透颅骨，所以在检测颅内肿瘤时以生物发光标记效果为好。通过这一成像系统，可以观察活体动物体内肿瘤的生长及转移、特定基因的表达等生物学过程。

2.核素成像

核素成像技术是利用放射性同位素作为示踪剂，对研究对象进行标记并进行活体成像的分析方法。包括正电子发射断层成像技术（positron emission tomography，PET）和单光子发射断层成像技术（single photon emission computed tomography，SPECT）。小动物PET和小动物SPECT是专为小动物实验而设计，探测区域小，空间分辨率高。PET和SPECT都是利用放射性核素的示踪原理进行显像。PET与SPECT相比具有更高的灵敏度，而SPECT则可以允许同时对多种事件进行分开检测。二者都可在分子水平上提供多种生理信息，可用于发现易于为核素标记的既定靶目标底物的存在，或用于追踪小量标记基因药物和药物代谢等。通过扫描对活体组织中的生理生化代谢过程如能量代谢、脂肪酸代谢、蛋白合成及神经递质合成、血流量、受体-配体结合及氧气利用率和药物代谢等作出分析。

3.磁共振成像

磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）是利用核磁共振原理，依据所释放的能量在物质内部不同结构环境中不同的衰减，通过外加梯度磁场检测所发射出的电磁波，绘制出物体内部结构图像的一种成像技术。MRI最大优点在于无电离辐射（放射线）损害、高度的软组织分辨能力。能同时获得生理、分子和解剖学信息等。笔者所在团队利用小动物MRI监测动物颅内胶质瘤的生长状况，如图2-2所示，在大鼠颅内接种C6一周后，检测到颅内肿瘤的形成。

传统的MRI是以物理、生理特性作为成像对比的依据。而MRI的分子成像技术是建立在上述传统成像技术基础上，以特殊分子作为成像依据。MRI特异性分子探针通常由转运体、MR显像剂和靶向性配体组成。转运体常用的有纳米颗粒、病毒载体及多聚糖等；MR显像剂有顺磁性复合物Gd-DTPA和超顺磁性氧化铁颗粒SPIO等；靶向配体则是指靶器官或组织所表达的标记物。

选择敏感度及特异度较高的靶器官或组织的标记物及其相应配体是靶向成像成败的关键。但由于MRI分子成像的微克分子水平较核素成像的纳克分子水平相比，敏感性较低，不具优势。20世纪90年代，提出了多模式成像概念。就是利用2种或2种以上医学影像学方法对同一物体进行成像以获得补充信息，或比较、验证不同成像方法得到的结果。多模式成像方法近年来由于一些关键技术的突破，应用前景日渐明朗。如在胶质瘤领域，就有将MRI与SPECT或PET结合应用获得良好结果的研究。如Varma（2013）等将携带有hNIS基因的腺病毒转染入内皮前体细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）并用铁离子进行标记（铁离子用于MRI成像，hNIS用于SPECT成像），利用MRI与SPECT两种成像技术检测，发现在U251颅内胶质瘤荷瘤裸大鼠中，铁离子阳性细胞和表达hNIS的细胞可被MRI和SPECT分别识别并成像。随后的免疫组化证实，这些被识别的细胞包括EPCs细胞和被转染的肿瘤细胞，同时亦证实了EPCs向肿瘤内部的迁移，提出EPCs作为基因治疗载体和成像探针的可能性。利用多模式成像可以实现结构成像和功能成像的完美结合，实现在结构成像基础上的包括基因表达与基因治疗成像、分子水平定量评价肿瘤血管生成、显微成像、活体细胞及分子水平评价功能性改变等诸多领域的研究。

动物的移植模型为脑胶质瘤的基础与临床研究提供了强有力工具。如肿瘤的增生、侵袭、血管生成及新治疗方法的筛选和新型成像技术的评估等。但无论是同种移植还是异种移植，由于移植所采用的胶质瘤细胞系多经过了长时间的培养和传代，基因表型或分子标识或多或少发生改变，已不能充分代表原有胶质瘤性质；人类胶质瘤细胞系经过动物血清培养，大多丧失了典型的人脑胶质瘤组织病理特征。所以，传统的移植模型并不能充分模拟人类肿瘤的发生。

有证据显示，同种模型在临床前期研究中不具备预测性。一项运用临床前肿瘤模型评估31种肿瘤药物细胞毒性的研究显示，同种异体移植模型在Ⅱ期临床试验中的实效性有限。而异种移植主要有以下两个缺陷：一是受体动物缺乏免疫功能；二是接种肿瘤的实验方法。大多数原位异种移植胶质瘤模型是通过将人的胶质瘤细胞接种到免疫缺陷小鼠颅内实现的，显然这种肿瘤形成过程全程缺乏免疫监视，肿瘤形成过程不具代表性。除此之外，由于免疫缺陷小鼠的DNA修复功能受损，使得它们无法接受一些新的治疗方法（如放疗）；另一潜在缺陷是肿瘤的形成是由于向颅内注射一定量的肿瘤细胞，这种肿瘤形成方法与自发性肿瘤形成有很大区别。所以，虽然胶质瘤的移植模型是目前研究最为广泛的胶质瘤模型，也是胶质瘤动物模型中使用最多的方法，但由于其固有局限或缺陷，需要不断开发新的胶质瘤模型以开展各项相关研究。