第四节　脑胶质瘤的转基因模型

近年来，伴随着人类对肿瘤发生相关基因的深入研究，以及转基因技术和基因剔除技术的快速发展，一种新型动物模型，即转基因动物模型应运而生。广义的转基因动物概念是指对动物基因组的改造或修饰，获得通常可种系传代的遗传性状，以此建立的动物模型称为转基因动物模型；狭义的概念则是指将外源基因导入动物基因组并获得表达所建立的可种系传代的动物模型。

小鼠是最常用的转基因动物，小鼠的转基因模型能提供相当一部分致癌基因组学研究资料，能鉴别更多在肿瘤进展过程中发生改变的基因。此外，还可用于明确特定基因的致癌性，同时还能利用特定基因突变的工程化小鼠分析协同基因网络、信号通路以及测试药物作用等。由小鼠所建立的转基因动物模型与人类疾病具有较高的基因相似度，在肿瘤研究中起着重要的作用。

一、转基因胶质瘤动物模型制备的病因学基础

胶质瘤的发生与许多原癌基因激活和抑癌基因失活密切相关。通过对胶质母细胞瘤患者样本的研究发现，大多数胶质母细胞瘤患者的肿瘤组织中存在p53、INK4a及EGFR和NF-1的突变。许多研究表明，p53和PTEN的表达下调，血小板源性生长因子（PDGF）及其受体（PDGFR）和表皮生长因子（EGF）及其受体（EGFR）的表达上调等与人类胶质母细胞瘤的发生密切相关。此外，血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（VEGFR）以及相关信号转导通路，有丝分裂原激活蛋白激酶（Ras/MAPK）和磷脂酰肌醇激酶（PI3K/AKT）通路等活性也被证明与胶质瘤的发生发展密切相关。

研究者们基于上述对胶质瘤发生分子机理的认识，通过不同癌基因和抑癌基因的组合，设计出各种转基因动物模型或基因工程化动物模型，用以诱发内生性脑胶质瘤的发生。有研究显示，小鼠的胶质瘤与人类胶质瘤的基因型改变极其相似，因此，小鼠已成为最主要的转基因模式动物。

Holland（2000）等通过组织特异性转基因技术，将结构性活化的Ras和Akt导入神经前体细胞，使二者在神经前体细胞中持续表达，诱发出小鼠的高级别胶质母细胞瘤，并证明单一Ras或Akt的导入并不足以诱发小鼠的胶质瘤发生。Reilly（2000）等敲除小鼠生殖细胞肿瘤抑制基因p53和NF1，发现此类小鼠易罹患并发展成病理分级不等的星形细胞胶质瘤。Zhu（2001）等利用Cre-Lox介导的条件性EGFR敲入（Konck-in）转基因小鼠研究了EGFR条件性表达联合p16Ink4a/p19Arf或PTEN表达丢失在胶质瘤发生中的作用，发现EGFR过表达并伴有p16Ink4a/p19Arf基因丢失或PTEN基因敲除的小鼠易罹患高侵袭性胶质母细胞瘤。此外，还有研究表明参与细胞周期调控的因子如p53、INK4a或ARF，单基因丢失不足以触发胶质瘤发生。

基于胶质瘤发生的分子事件所建立的转基因动物模型与肿瘤细胞接种的胶质瘤模型有着根本性的差别。基因工程化模型在肿瘤发生、进展、治疗反应和组织学改变与分子改变具有明显的因果关系。因此，转基因模型在很大程度上可以帮助人类理解肿瘤发生、进展、转移等方面的分子信号通路，并且拓展对肿瘤微环境的认识。这些模型阐述了致癌基因和抑癌基因在肿瘤发生过程中的作用。运用该模型也能提高对某些单个基因的认识，以及这些基因突变后在肿瘤发生中的作用。总之，转基因胶质瘤动物模型的建立促进了对胶质瘤发生、转移等分子机制研究，以及肿瘤微环境和临床前试验等研究。反过来，其发生机理的阐明又为建立新型转基因动物模型提供了更多选项。

二、制备转基因动物模型常用技术

目前转基因动物模型制备技术大体上有显微注射法、基因打靶技术、基因捕获技术和转座子技术以及病毒介导的转基因技术等，相信伴随着基因工程技术的发展，会呈现更多模型可供选择。

（一）显微注射技术制备转基因动物模型

即通过对受精卵的原核进行DNA注射，获得的转基因动物模型。1974年，Jaenisch等用显微注射法将SV40的DNA导入到小鼠胚囊中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。证明了将外源基因导入胚胎细胞并实现整合的可能。此模型操作相对简单，技术要求较低，周期较短。但缺点是外源基因整合至基因组的效率较低；随机整合，转基因整合的位点和拷贝数无法控制，造成转基因的表达差异很大，筛选高表达转基因动物的工作量较大。

（二）基因打靶技术（gene targeting）制备转基因动物模型

基因打靶是目前胶质瘤转基因动物模型制备中最常采用的一项技术，是基于同源重组原理而设计。在这一技术中，体内基因组中某一目的基因相关DNA序列被视为“靶基因”，欲导入的外源基因DNA序列被视为“弹头”，导入的外源基因即“弹头”必须与靶基因有一定的同源序列，这一段同源序列被称为同源重组指导序列（homologous recombination directing sequences，HRDS）。基因打靶技术就是利用载体，通过同源重组对体外培养的胚胎干细胞（ES细胞）基因组的特定位点进行遗传改造或修饰，然后将这种经改造或修饰的ES细胞经囊胚注射，获得嵌合动物，最后获得可以种系传代的转基因动物。

基因打靶技术的基本流程为：①打靶载体的构建；②外源基因导入ES细胞；③重组阳性的ES细胞显微注射入囊胚——植入假孕鼠子宫——获得嵌合体（chimera）小鼠；④嵌合体小鼠回交（backcross），即出生的雄性小鼠与提供囊胚的正常雌性小鼠交配；⑤打靶杂合子小鼠互交（intercross），即选择杂合基因型小鼠（-/+）交配；⑥筛选出纯合子（homozygotes）基因打靶小鼠。

通过基因重组，可实现：①基因敲入（gene knock-in）：即在受体细胞基因组中定点引入原本不存在的一个新基因；②基因敲除（gene knock-out）：即在受体细胞基因组中引入一特定序列DNA，用以定点灭活某一内源基因；③基因替代：即靶基因被导入的外源基因替代，可以是正常基因替代突变的基因，也可是突变基因取代正常基因。

目前胶质瘤的转基因模型制备中常用的打靶技术有以下几种：

1.抑癌基因外显子敲除（knock-out）技术

在体外进行胶质瘤抑癌基因外显子的缺失突变，即构建携带突变基因的载体，并导入到ES细胞，然后将这种经改造的ES细胞经囊胚注射，获得嵌合动物，最后获得可以种系传代的转基因动物。

2.致癌基因敲入（knock-in）技术

体外构建携带胶质瘤致癌基因载体，并将其导入ES细胞，然后将这种经改造的ES细胞经囊胚注射，获得嵌合动物，最后获得可以种系传代的转基因动物。

3.条件性（conditional）基因导入或敲除技术

条件性转基因技术，即Cre-LoxP技术。在Cre-LoxP位点特异重组酶系统中，Cre重组酶（cyclization recombinase）是来源于P1噬菌体的一种位点特异性DNA重组酶，可特异性介导两个34bp的LoxP位点之间的DNA序列发生重组，使LoxP位点间的序列或基因被删除；LoxP位点是由两个13bp的反向重复序列和8bp的间隔序列组成，其中反向重复序列为Cre酶的结合位点，间隔序列决定LoxP的方向。根据上述原理，Cre-LoxP系统设计策略可分两步走：①在靶基因同源DNA序列两侧引入LoxP位点及选择性标志基因，通过基因重组在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，然后按经典的基因打靶方法制备转基因小鼠；②制备另一转基因小鼠，这种转基因小鼠在构建载体时，可将Cre基因构建在特异性启动子或诱导性启动子下游，实现基因表达的特异性表达调控及时空控制。譬如引入GFAP、S100β或Nestin等基因的神经胶质细胞特异性启动子即可实现其所控制基因在神经胶质细胞中的特异性表达调控；如引入雌激素受体（estrogen receptor，ER）制备Cre-ER转基因小鼠，可使其只有在注入雌激素时才可诱导Cre-ER的大量表达，实现表达的时间控制。最后，将前述两种转基因小鼠交配，并筛选出阳性重组鼠，即可得到删除外源标记基因的条件性基因导入或敲除小鼠。

Zhu（2005）等将cisp53+/-：NF-1+/flox小鼠和hGFAP-cre转基因小鼠交配，传代并筛选出cisp53+/-：NF-1+/flox：hGFAP-cre基因型小鼠，58例该型小鼠出生后全部罹患了中枢神经系统肿瘤，其中70%为胶质母细胞瘤并具有人类胶质母细胞瘤组织学特征，如假栅栏样排列的肿瘤细胞、坏死灶、微血管形成和增生等；再将上述基因型小鼠（cisp53+/-：NF-1+/flox：hGFAP-cre）与cis p53+/-：NF-1flox/flox小鼠进行交配，获得的p53-/-：NF-1flox/flox：hGFAP-cre基因型小鼠，此型小鼠大多发生不同病理级别的颅内神经胶质瘤，从Ⅱ级、Ⅲ级到Ⅳ级不等。GFAP（glial fibrillary acidic protein）是一种胶质纤维酸性蛋白，在中枢神经系统星形胶质细胞中广泛表达，被认为是成熟神经胶质细胞特异性分子标记物，人类GFAP启动子（hGFAP）被认为在神经前体细胞中也具有活性，可特异性调控其下游基因在这些细胞中的表达。Zhu（2005）等就是利用了Cre-LoxP技术，通过条件性敲除并引入人类GFAP启动子，使小鼠在后天生长过程中P53和NF-1表达缺失，制备出条件性敲除小鼠胶质瘤模型。

传统的建立在受精卵和胚胎干细胞基础上的基因导入或敲除技术，由于靶基因在所有体细胞的基因组上都发生相应基因改变，常常导致动物死于胚胎期而不能存活；或导致肿瘤发生在其他器官和组织。其所引发的肿瘤是在胚胎发育期通过人为改变基因表达而实现，与人类肿瘤的后天发生存在差异，限制了其应用。而以Cre-LoxP位点特异重组酶系统与基因打靶技术以及基因表达调控系统相结合的条件性基因打靶由于可实现基因表达的时空控制和基因的组织特异性表达，很好地解决了上述存在的问题。运用这一技术，可使外源基因定点整合到染色体上或将特定的DNA片段删除，实现外源基因的组织特异性表达以及基因表达的时空控制。

（三）基因捕获技术（gene trapping）

基因捕获技术就是首先要建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，筛选基因的显性突变或隐性突变。然后通过化学致癌剂ENU的乙烷化反应，导致DNA的随机、单碱基突变。

（四）转座子介导的基因打靶技术

转座子又称移动基因，跳跃因子，是一类散布在基因组中序列重复的DNA片段，可以通过特定转座酶在基因组中移动，是DNA上可自主复制和移动的基本单位。转座子首先是在20世纪50年代，由McClintock（1951）在玉米中发现，后证实在各种生物界中亦广泛存在。现转座子系统已被应用于各种基因操纵技术中。如利用转座子在基因组内插入和切离并改变自身位置的特性，可使其携带外源基因整合到动物基因组内，从而制备转基因动物模型。

近几年，“睡美人”转座系统在胶质瘤转基因动物模型制备中优势渐显，前景看好。所谓“睡美人”转座系统是Tcl/mariner转座子超家族中的一员，已经失活了一千多万年。1997年，Ivics等根据积累的系统发生数据，利用生物信息学的方法，对其进行分子重建，唤醒了其转座活性，被称为“睡美人”苏醒。“睡美人”转座系统由两部分构成：①转座子；②转座酶。转座子的末端有两个倒置重复/直接（IR/DR）序列，两个DR均能与转座酶相结合。导入的外源基因可插在两个IR/DR之间。在转座酶作用下，“睡美人”转座子可与外源基因共同整合入宿主靶基因组DNA中。

Wiesner（2009）等利用“睡美人”转座系统将人类原癌基因整合入免疫活性小鼠的脑细胞基因组中，诱发出自发性脑肿瘤。在研究中，“睡美人”转座子质粒系统携带AKT、N-RAS、EGRFvIII基因和（或）p53特异性shRNA与另一编码转座酶基因的质粒共同注射入脑组织，诱发出不同病理分级的胶质瘤。其所诱发肿瘤的组织学类型和病理分级取决于所插入原癌基因的种类和组合方式，大多数肿瘤与人类的星形细胞胶质瘤或胶质母细胞瘤相似。在这一研究中证实，“睡美人”系统至少能携带包括报告基因在内的5种不同外源基因完成共同转染。

与条件性基因敲除等技术不同，“睡美人”转座系统具有以下优点：①操作相对简单，用时较短；②能携带较长片段外源基因，对所插入片段的长度限制较小；③转座的外源基因可以稳定整合到染色体中，而且通过生殖细胞传代后也能够长期表达；④转座酶可以催化单拷贝的基因精确地插入宿主DNA序列中，不再依靠随机整合且插入片段的大小也不会发生变化；⑤与外源基因共同整合入受体基因组的只是两侧各250bp的IR/DR序列，对外源基因的影响较小。基于以上特点，“睡美人”转座系统在基因筛选、功能基因组学及基因治疗等领域应用前景广阔。

（五）病毒载体介导的转基因技术

病毒载体介导的转基因技术，根据载体的不同又可分为腺病毒介导、反转录病毒介导和慢病毒介导。腺病毒载体感染效率高，但转染无特异性限制了其应用；反转录病毒基因组能稳定整合至宿主基因组中，但只能感染分裂细胞；慢病毒不仅能整合外源基因至宿主基因组，而且能感染分裂和静息非分裂细胞，应用前景看好。

目前，已有多种方法能够运用反转录病毒或腺病毒载体传递重组酶实现体细胞基因转移。与转基因小鼠携带生殖细胞系基因突变相反，反转录病毒通过体细胞基因传递基因改变。反转录病毒可以有选择性的感染细胞，其所携带的基因被插入到宿主细胞基因中，因此，受感染细胞的后代细胞均含有这种编码基因。病毒感染宿主细胞的效率依赖于病毒包膜基因编码的糖蛋白和宿主细胞表达的细胞受体之间的相互作用。所以，包膜蛋白能使反转录病毒感染的细胞类型具有高度选择性。例如，鸟类逆转录病毒载体（RCAS）及其受体TVA（RCAS/tv-a）系统就是运用鸟类白血病病毒（avian leukosis viruses，ALV）A亚群受体建立的，RCAS（replication-competent ALV splice）病毒载体来源于鸟类肉瘤白血病病毒（ASLV），该载体通过基因工程化修饰能够接受各种致癌基因的插入。该模型的主要优势在于可高度选择性地靶向神经前体细胞和胶质细胞的特定亚群。

另一种常用的病毒包膜类型是亲嗜性反转录病毒包膜，该包膜只能进入表达亲嗜性反转录病毒受体的大鼠和小鼠细胞。亲嗜性反转录病毒不会感染人类细胞，因此相对具有较高的安全性。然而，与ALV-RCAS病毒一样，亲嗜性反转录病毒包膜既不能耐受高速离心，也不能耐受反复冻融，这就限制了高滴度病毒的获得，但是可以通过一种来自不同病毒基因组的包膜蛋白包装病毒来突破这一限制。

立体定向注射反转录病毒，可以在特定时间和部位向细胞传递基因，该方法具有多个重要的优势。首先，向某些特定的近似胶质瘤早期的细胞群导入基因损伤，并可以通过细胞迁移和渗透传递该基因损伤。其次，向脑特定部位注射可以让研究者清楚地知道肿瘤生长起始时间和部位，并能观察肿瘤生长情况和治疗反应。再次，研究者可以在中枢神经系统的不同部位建立模型。因此，反转录病毒在分析成人或小儿神经系统某些特定区域细胞群的致瘤潜能具有重要的利用价值。例如，立体定向注射反转录病毒已被运用于研究不同部位的肿瘤形成，如皮质下白质、小儿室管膜下区、脑干以及成人脊髓。

病毒介导的转基因模型其肿瘤发生及类型受动物年龄、种系等影响。如反转录病毒介导的PDGF转染至成年大鼠白质，可诱发类似于人类脑胶质母细胞瘤的脑瘤形成，诱发率为100%。而当转染至新生小鼠脑，仅有不到40%鼠龄在14~29周的小鼠发生了脑肿瘤。此外，小鼠脑肿瘤的发生率和病理级别与PDGF的表达水平亦有关联。Shih（2006）报道，利用缺乏调节序列的反转录病毒介导PDGF在新生鼠中高表达时，100%的小鼠在4~12周时发展成为高侵袭性胶质母细胞瘤，肿瘤内富含新生血管，肿瘤细胞浸润如周围脑组织。

不同基因打靶技术的联合应用可实现不同研究目的的转基因小鼠的制备。在免疫活性鼠中，通过条件性敲除肿瘤抑制基因联合原癌基因的组织特异性过表达方式（通过组织特异性启动子）或联合病毒介导的原癌基因过表达方式已创建了一系列的与人类胶质瘤发生遗传学改变相类似的胶质瘤动物模型。Olson（2007）等利用p53基因敲除小鼠和GFAP-tgE2F1小鼠，制备出GFAP-tgE2F1：p53+/-和GFAP-tgE2F1：p53-/-小鼠模型，GFAP即胶质纤维酸性蛋白，GFAP启动子可控制基因只能在特异性的胶质细胞中表达，发现该模型小鼠在出生后7~18个月（相当于人类20~69岁年龄段）可自发性产生后天性的星形细胞胶质瘤（相当于WHOⅢ级）。Marumoto（2009）等采用Cre-LoxP系统结合编码原癌基因的慢病毒载体的立体定位注射方法，建立了一种多形性胶质母细胞瘤的转基因小鼠动物模型。研究中发现，将引入LoxP序列并编码Ras或AKT基因的慢病毒载体局部分别注射入GFAP-Cre免疫活性小鼠的大脑皮层、海马或室管膜下区域时，单独的Ras或AKT基因的表达并不能诱发脑胶质瘤的发生，而二者的联合导入在海马区域可诱使30%的小鼠罹患高侵袭性胶质瘤，在室管膜下区域仅有一例发生脑胶质瘤，而皮层下的注射并不能诱发胶质瘤的形成；将Ras和AKT的慢病毒载体立体定位注射入p53基因敲除小鼠可极大提高脑胶质瘤的发生率，在海马区域的诱发率达到100%，室管膜下区域则达到75%。在此项研究中，Marumoto（2009）等证实所诱发的肿瘤具有多形性胶质母细胞瘤生物学特点，同时其肿瘤细胞具有干细胞特性，CD133阳性，可悬浮样生长形成神经细胞球，具有向神经元和星形胶质细胞分化的能力。证实Cre-loxP所控制的慢病毒载体的立体定向导入不失为一种很好的胶质母细胞瘤转基因动物模型制备方法。提示，通过在慢病毒载体中插入各种原癌基因，联合不同类型基因条件性敲除或导入的转基因动物，可以在不同组织和器官制备不同种类的转基因动物模型以适应不同研究之需。

三、几种类型的转基因胶质瘤动物模型及其应用研究

首个生殖细胞系基因工程化小鼠脑肿瘤模型是通过过表达病毒致癌基因得以实现。随后，在某些特定细胞基因中，“功能获得”或“功能缺失”的生殖细胞系修饰方法得以进一步发展。在很多方面，生殖细胞系修饰方法能模拟人类遗传性肿瘤易感因素和症状。这些模型通过一群基因工程化转变的细胞而促使肿瘤发生。同样，他们具备的基因改变特点能促进肿瘤发生，也足以使正常细胞发生肿瘤转化。

随着时间的推移，基因工程化模型制备方法变得更为丰富、更为复杂，例如特定细胞中某些特定阶段的多个基因过表达或表达缺失的操纵。通过组织特异性方法或者时间特异性方法控制基因的表达；运用反转录酶病毒或腺病毒载体传递重组酶实现体细胞基因转移；通过改变某些信号通路而建立脑肿瘤模型，如Rb、RAS和AKT通路。在人脑星形细胞瘤中，pRB功能障碍出现频率很高。星形细胞瘤转基因模型的建立是通过表达SV40 T抗原，该抗原能组织特异性灭活Rb家族蛋白，阻断Rb通路，并稳定表达GFAP启动子。当该基因在发育后期表达时，100%的小鼠在10个月内会产生间变星形细胞瘤。此外，在这种模型中，联合灭活PTEN基因能诱导肿瘤细胞的生存率和侵袭性随着血管生成的增加而提高。

为研究RAS通路在胶质瘤发生中的作用，通过人GFAP启动子控制活化Ras的条件性表达，从而建立转基因模型。研究者制作了一系列各种不同Ras表达水平的转基因模型（GFAP-V12Ha-ras）。极度高表达具有高度活性V12Ha-ras的小鼠，在出生2周后死于颅内多发胶质母细胞瘤。在95%的动物模型中，适度提高V12Ha-ras表达水平将会导致不同恶性级别的星形细胞肿瘤，50%的小鼠在出生后3月肿瘤形成。GFAP-v-src转基因小鼠在出生后2周形成增殖性星形细胞肿瘤巢，并有14%的小鼠在出生后65周产生明显的脑及脊髓恶性星形细胞瘤。RCAS/tv-a模型已被应用于使活化突变型K-Ras和Akt向Nestin阳性神经干细胞转化。单独激活Ras或Akt不能产生肿瘤，联合Ras和Akt则不能有效诱导GFAP阳性星形细胞产生肿瘤，该结果表明激活某些信号通路以及原始细胞分化状态的重要性。Ras的致瘤作用在转基因模型和体细胞特定基因转移方法中的不同处在于转基因模型中会出现次级突变现象。例如，当Ink4a-Arf基因缺失小鼠与Ntv-a或Gtv-a转基因小鼠杂交并感染RCAS-K-Ras，则该小鼠会出现肉瘤样组织改变。这说明Ras能与Akt激活或者Ink4a-Arf缺失产生协同作用，促进各种不同病理特征的胶质瘤发生。RCAS/tv和Cre/Lox系统的联合产生了Ras胶质瘤模型，该模型为PTEN基因缺失。然而，上述肿瘤模型中“功能获得”并不是由人脑胶质瘤中发现的某些特定基因或基因突变决定的，而是胶质瘤某些信号通路中基因活化所决定。在人脑胶质瘤中，常出现通过激活上游酪氨酸受体（receptor tyrosine kinase，RTKs）而活化这些信号通路。

动物模型应尽可能模拟人类肿瘤的多种生物学特性，包括组织学、肿瘤生物学和肿瘤特定基因改变。表2-5对近年来的转基因动物胶质瘤模型做一概括。从中可见，转基因动物模型虽然种类繁多，但大都围绕着人类胶质母细胞瘤特征性的基因改变如p53、INK4a/ARF、PTEN、EGFR、PDGF等基因的改变而设计。

这里我们重点介绍三种由特定基因致瘤的胶质瘤亚型基因工程化小鼠模型，NF1、EGFR和PDGFR三类。这三种模型具有明显差别并有不同表现，EGFR激活与其受体扩增或突变相关，PDGF信号通路激活主要由于其配体决定，以及NF1模型则是由于NF-1表达缺失。

（一）PDGF小鼠胶质瘤模型

血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）发现于血浆中，最初纯化自人的血小板中。之后，研究者发现PDGF同样也能分泌自一些其他细胞类型，包括巨噬细胞、上皮细胞及内皮细胞。有报道显示PDGF能促进细胞增殖、迁移以及体外多种细胞类型的存活。PDGF蛋白存在五种活化二聚体形式：AA、BB、AB、CC和DD。PDGF受体有两种亚型：PDGFα和β，该受体在功能和结构上都属于酪氨酸激酶受体家族。与PDGF结合后，受体活化激活下游信号通路，包括PI3K/Akt、RAS/MAP激酶和PLC/PKC通路。对于脑组织中PDGF的作用，体外研究显示PDGF直接刺激胶质前体细胞增殖、迁移。细胞培养中，联合运用PDGF和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）能使胶质前体细胞具有更强的自我更新能力和分化抑制能力。为进一步分析PDGF在体内实验中的作用，研究者建立了PDGF基因敲除小鼠和PDGF过表达转基因小鼠模型，转基因小鼠模型由神经特异性烯醇酶（neuro-specific enolase，NSE）启动子控制。来自于这些模型的分析数据显示，中枢神经系统一些前体细胞受到周围环境中不同水平的PDGF调控。

首次表明PDGF对胶质瘤发生有促进作用是来源于一项研究，该研究显示向新生绒猴颅内注射猴肉瘤病毒（simian sarcoma virus，SSV）能诱导胶质瘤发生。SSV中v-sis致癌基因被认为与PDGF-B基因同源。还有数据显示v-sis基因产物能单独作为一种PDGF受体激动剂，促进人成纤维细胞转化。这些发现表明PDGF在胶质瘤发生中的潜在致癌作用。此后发现，PDGF信号通路不仅涉及脑肿瘤，也广泛参与人类其他恶性肿瘤的发生。人脑胶质瘤和胶质瘤细胞系常共同表达PDGF配体及其受体，而且PDGFRα在一些高级别胶质瘤中扩增，这表明存在一种包括PDGF及其受体的自分泌环路。小鼠模型证实该自分泌环路在肿瘤进展中是一个重要事件，并明确PDGF与胶质瘤形成存在因果关系。

运用反转录病毒制备的胶质瘤模型已证实PDGF在胶质瘤形成中的重要作用。第一个反转录病毒胶质瘤模型是在绒猴颅内建立的，运用猴肉瘤病毒和其辅助病毒猴肉瘤相关病毒（simian sarcoma-associated virus，SSAV），该模型肿瘤具有胶质母细胞瘤病理特征。后续研究发现，SSV癌基因v-sis是PDGF-B基因的一种反转录病毒同源体，这更有力地证实了PDGF在胶质瘤中的重要作用。

第一个PDGF小鼠胶质瘤模型是运用莫罗尼小鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus，MMLV）携带PDGF-B基因制备的。表达PDGF-B的病毒与其辅助病毒一同被注入新生小鼠右侧大脑半球中，40%的小鼠在注射后14~29周内产生肿瘤。在这些研究中一些肿瘤显示出胶质母细胞瘤组织学特征（渗透性、假性栅栏样坏死和血管增殖等），然而其他的肿瘤更接近于原始神经外胚层肿瘤。这种可变性可能是由于在肿瘤自发形成过程中额外的基因损伤造成的，或者可能是基因插入突变的结果。另外，该变化也可能是反转录病毒最初感染细胞类型和分布的不同造成的。新生小鼠大脑包含多种前体细胞和细胞类型，这些细胞的感染决定于病毒注射的时间和部位。

第二种PDGF-B过表达新生小鼠模型利用了上述ALV RCAS载体，该模型需要ALV受体tv-a，其优势在于tv-a可以由特定细胞群表达，而这些特定细胞群则受到不同的细胞特异性启动子（如GFAP或Nestin）控制。将表达PDGF的RCAS病毒注射入GFAP/tv-a小鼠体内，在12周时40%的小鼠产生肿瘤，这些肿瘤与少突胶质细胞瘤或者混合型少突星形细胞瘤类似。当相同的病毒注射入Nestin/tv-a小鼠体内时，肿瘤发生率超过60%，其组织学特征更接近于低级别少突胶质细胞瘤。后续研究运用RCAS系统在更高水平上表达PDGF则显示出肿瘤发生的PDGF剂量依赖关系，注射该病毒的97%小鼠产生肿瘤，潜伏期更短，肿瘤组织学类型更类似于间变性少突胶质细胞瘤。

最近，第三种tv-a转基因模型Ctv-a产生了，在该模型中，RCAS感染仅限于表达2′，3′-环状核苷酸-3′磷酸二酯酶的有髓鞘的少突胶质前体细胞。这三种转基因新生小鼠模型被运用于过表达PDGF-B，以制备不同部位的小儿高级别或低级别胶质瘤模型，包括大脑皮层、脑干以及小脑等部位。在PDGF过表达的肿瘤中，同时也能发现一些与胶质瘤相关的肿瘤抑制基因表达缺失，例如ink4a-arf，p53和PTEN。

最近几年的多项调查证实，尽管成人和儿童胶质瘤在组织学上无明显区别，但是它们在部位、生物学行为以及分子特征上存在不同。提示在这两类人群中恶性胶质瘤发生的分子信号通路和病理生理学特性是不同的。成人与儿童胶质瘤的这些不同可能能够预测肿瘤治疗效果。例如，成人胶质瘤通常会有EGFR过表达以及PTEN缺失或者突变。相反，这些改变在儿童恶性胶质瘤中却是少见的。为设计一种动物模型能反映这种差异，成人胶质瘤模型建立通过在Nestin阳性和GFAP阳性细胞中过表达PDGFB，联合或者不联合肿瘤抑制基因。这些小鼠模型对分析成人胶质瘤的位置、遗传背景以及不同细胞对放疗、化疗反应等方面的作用是一个极佳的研究工具。成人临床前研究数据可以作为相应的小儿肿瘤研究数据的评估工具。

由于胶质瘤常常存在p53基因突变和（或）缺失，并常常并存PDGF信号通路的改变，为研究这一现象，研究者制备了包含这些特定基因改变的工程化小鼠模型。此类模型中，人PDGFB（human PDGFB，hPDGFB）受控于人GFAP（human GFAP，hGFAP）启动子小鼠在培育过程中成为p53缺失模型鼠。在小鼠2~6个月龄时，肿瘤显示出人脑胶质母细胞瘤特征。基因工程化模型和条件性激活小鼠模型被用于制备PDGF原发性髓内星形细胞瘤，该肿瘤模型在组织学上和病理学上与人类肿瘤几乎难以分辨。前者运用四环素反应体系表达hPDGFB，hPDGFB受控于GFAP启动子，该启动子可以调节四环素转录激动子tTA，tTA可以被多四环素抑制。后者利用hGFAP启动子调节hPDGFB mRNA表达，从而研究脊髓肿瘤的发展。

利用RCAS/tv-a系统制备的PDGF小鼠模型过去常用于研究细胞起源和微环境作用。运用GFAP和Nestin阳性细胞过表达PDGF并联合Ink4a-ARF基因缺失制备胶质瘤，该肿瘤模型具有相同的发生率。

立体定向注射RCAS-PDGF Nestin阳性或GFAP阳性细胞于成年小鼠室管膜下区（SVZ）或皮质部，都显示同样的肿瘤发生率和潜伏期。当GFAP或Nestin阳性细胞中PDGF过表达时，小脑和（或）脑干胶质瘤形成，而注射于小脑的肿瘤形成潜伏期长于注射于SVZ和皮质部的肿瘤。这些数据显示模型中Nestin阳性干细胞/前体细胞以及GFAP阳性细胞可能转化为肿瘤细胞。GFAP阳性细胞代表SVZ干细胞群，但是在皮质和小脑部成为星形细胞。众所周知皮质最外层星形细胞在免疫组化染色时为GFAP阴性，立体定向注射引起皮质星形细胞激活并上调表达GFAP，从而成为RCAS载体感染对象。这些结果证明在某些实验条件下，分化的星形细胞和干细胞/前体细胞能够成为胶质瘤的起源细胞。最近的研究显示，有髓少突胶质前体细胞（oligodendrocyte progenitor cells，OPCs）同样可以是胶质瘤的细胞起源。在成年和新生小鼠的Nestin阳性细胞和新生小鼠OPCs中过表达PDGF，能形成类似于人脑少突胶质细胞瘤。这些肿瘤染色显示Oligo-2阳性，其组织学特征与人脑少突胶质细胞瘤相似。当新生小鼠或成年小鼠GFAP阳性细胞过表达PDGF时，则出现混合性胶质瘤，该肿瘤组织学形态类似于人脑混合性星形细胞瘤。

上述PDGF诱导的胶质瘤模型已被用于胶质瘤治疗的临床前研究，Nestin-tv-a/ink4a-arf-/-系统和GFAP-tv-a/ink4a-arf-/-系统中过表达PDGF能产生90%~95%高级别胶质瘤。MRI强化扫描能显示肿瘤与微血管增殖区域相关性，T2加权像异常信号与肿瘤细胞侵袭性相关。研究显示，替莫唑胺能延长荷瘤小鼠存活时间。mTOR抑制剂CCI779和PDGF/VEGF抑制剂PTK787能实现同样的肿瘤生长抑制效果。

（二）Nf1小鼠胶质瘤模型

I型多发性神经纤维瘤病（Neurofibromatosis type 1，NF1）是一种临床症状表现复杂的单基因遗传病，为Nf1基因突变所导致。由于Nf1基因纯合突变所致的表型是致死的，所以NF1个体往往是Nf1基因杂合突变。罹患NF1的儿童容易发生低级别胶质瘤，在所有报道的NF1病例中约有15%的病例为WHO I级星形细胞瘤。NF1患儿在平均4.5岁时产生的低级别毛细胞星形细胞瘤多位于视觉通路前部。最近在小鼠基因工程化的研究进展中显示，Nf1突变的小鼠视神经和视交叉部可形成低级别胶质瘤，这些基因工程化小鼠在鉴别重要的调节胶质细胞存活、增殖中具有重要作用，并在确定肿瘤微环境如何调节肿瘤形成和生长具有指导意义。NF1是神经系统最常见的肿瘤易感因素之一，NF1患者的典型表现为色素沉着异常，包括皮肤色素斑、腋窝或腹股沟雀斑以及虹膜色素沉着错构瘤。此外，成年NF1患者还有周围神经鞘瘤，儿童患者容易发生明显的骨骼发育异常、学习能力低下、心血管系统缺陷以及颅内肿瘤，大多数NF1患儿的脑肿瘤为毛细胞星形细胞瘤。

从功能上讲，Nf1基因是抑癌基因，其编码的神经纤维瘤蛋白由2818个氨基酸残基组成，是一种肿瘤抑制蛋白。Nf1肿瘤抑制基因主要与遗传性疾病I型多发性神经纤维瘤病相关。I型神经纤维瘤病是由于生殖细胞系突变导致，全世界范围内发病率约为1/3500，该病的主要特征为神经系统肿瘤。然而，多发性神经纤维瘤病主要是外周神经系统肿瘤，多达50%的NF1患者有良性的视神经毛细胞星形细胞瘤。此外，相对于普通人群，恶性胶质瘤患者存在更高的生殖细胞系Nf1突变率。因此，Nf1肿瘤抑制基因可以被认为是胶质瘤的遗传易感因素。近期发表的散发人脑胶质瘤TCGA（the cancer genome atlas，癌症基因组图谱）数据强烈支持Nf1与胶质瘤之间的因果关系，Nf1突变率与其他多个肿瘤抑制基因相似，例如PTEN、p53、Rb和CDKN2A等。

Nf1基因编码的神经纤维瘤蛋白，其主要功能就是作为Ras-GTPase激活蛋白（GTPase-activating protein，RasGAP），激活体内Ras-GTP酶，导致结合状态的GTP水解，Ras蛋白失活。Nf1是Ras信号转导的一种负调节因子，而Ras蛋白是GTP酶超家族中一员，该超家族介导膜受体到细胞内激酶级联反应的信号转导。Ras蛋白在失活的GDP绑定状态和活化的GTP绑定状态之间循环。Ras基因是原癌基因，正常情况下受Nf1蛋白的严格调控和制约。当Nf1表达缺失Ras激活，就可能发生机体癌变，产生神经纤维瘤或其他神经肿瘤。EGFR扩增或激活突变，PDGF过表达和PDGFR扩增，或者Nf1突变被认为是激活Ras通路及其下游因子的三种机制。

Jacks（1999）等人首次报道了Nf1小鼠胶质瘤模型。Nf1和p53功能杂合缺失导致小鼠自发产生胶质瘤，小鼠和人类Nf1和p53基因位于相同的染色体。这种小鼠模型的限制性在于不完全和不稳定的肿瘤发生率和时间范围。

第二代Nf1小鼠胶质瘤模型运用条件性（Cre/LoxP）肿瘤抑制等位基因连同Cre重组酶表达转移基因，该转移基因能在特定细胞中使肿瘤抑制基因诱导失活。该模型的另一个特征是只在每个肿瘤抑制基因（NF1和p53）的等位基因上才包含生殖细胞系条件性突变或无突变。Cre转基因已被证明表达于胚胎端脑前体细胞和成人神经干细胞，Cre联合Nf1和p53等位基因杂交入小鼠，制备出胶质瘤模型。分离出的肿瘤细胞表现出Nf1和p53肿瘤抑制基因LOH（Loss of heterozygosity，杂合性缺失），然而脑中非肿瘤细胞则保留了野生型Nf1和p53等位基因。这些小鼠产生的肿瘤表现出的病理特征为Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤，这表明Nf1和p53基因突变足以形成恶性胶质瘤。此外，基因改造手段也被应用于这种小鼠模型，进一步证实了肿瘤抑制基因片段缺失的重要性。只有在p53完全缺失，并且早于或者同时发生Nf1缺失，肿瘤才能形成。如果Nf1缺失早于p53缺失，则肿瘤不能形成。这些结果证实基因突变事件在肿瘤形成中具有非常重要的作用。

Nf1转基因小鼠胶质瘤模型的建立为肿瘤形成前期脑组织病理研究提供了新思路，这些研究揭示了转基因小鼠形成胶质瘤最早期在室管膜下区的异常改变。这些模型可运用于检测PTEN抑癌基因缺失的作用。PTEN突变常出现于人脑高级别胶质瘤中，但是在低级别胶质瘤中尚未检测到。有研究发现，在Nf1和p53缺失中包含一个杂合的条件性PTEN等位基因，导致了高级别胶质瘤形成。这些结果表明，人脑原发性胶质瘤中PTEN基因突变可能在低级别向高级别转化过程中起着重要作用。

基因工程化小鼠模型是研究胶质瘤自然史和进展的重要工具。诱导性Cre重组酶转基因的运用能在时间和空间上诱导Cre重组酶，使其成为研究下述问题的强有力的工具。例如，运用神经特异性启动子Nestin控制Cre重组酶雌激素受体融合蛋白，该方法依靠雌激素拮抗剂激活中枢神经系统内特定的神经前体细胞巢。中枢神经系统中干细胞或前体细胞中Cre重组酶的特异性激活，为Nf1和p53缺失诱导胶质瘤形成提供了证据。相反，在成人脑中非干细胞或前体细胞中，用病毒注射Cre重组酶诱导自身抑癌基因表达缺失并激活星形胶质细胞聚集，则没有肿瘤形成。这些实验数据得出相一致的结论：在Nf1胶质瘤模型中，运用Nf1突变方法产生的肿瘤来源于干细胞，而不是来源于分化后的细胞。

上述实验主要通过使Nf1缺失作为一种突变使肿瘤中Ras通路激活。如果用PDGFR或者EGFR突变代替Nf1突变，检测是否这些突变能得到截然不同的临床结果，是否在脑中相同细胞或不同细胞中具有相同的成瘤易感性，根据上述研究，很可能Nf1胶质瘤模型主要在干细胞中产生，而PDGFR或EGFR胶质瘤模型主要发生于分化程度更高的细胞中。

Nf1相关视路胶质瘤小鼠模型是最早试图通过利用杂合小鼠使Nf1突变失活建立的Nf1动物模型，该Nf1+/-小鼠能够存活且有生育能力，但是缺乏Nf1伴发肿瘤的特点。为加快肿瘤形成，Nf1+/-小鼠相互杂交形成Nf-/-小鼠，然而这些小鼠在胚胎形成时由于心脏缺陷而死亡。为避免Nf1双等位基因缺失引起的胚胎致死率，Parada（2005）及其同事制备了Nf1条件性敲除小鼠模型，该模型可以通过Cre-Lox技术在特定组织和细胞类型中使Nf1基因失活。有研究者通过GFAP启动子控制Cre重组酶表达，使星形胶质细胞中Nf1失活，从而Nf1蛋白表达缺失。该模型详尽阐述了与视路胶质瘤生长相关的神经纤维瘤蛋白在星形细胞中的生长调节机制，此外，该Nf1突变小鼠模型既能说明肿瘤微环境对胶质瘤形成和生长的作用，同时也为治疗药物检验提供了一个很好的临床前期模型。

（三）EGFR小鼠胶质瘤模型

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一种原癌基因，它在多种肿瘤中存在过表达现象，并且是高级别胶质瘤的一个主要致癌基因，报道显示超过50%的肿瘤中存在过表达和突变。EGFR属于酪氨酸激酶受体ErbB家族，在结构和序列上具有同源性。有证据表明该家族成员在恶性肿瘤转化中起到十分重要的作用。除了EGFR，ErbB2（或者Her2/neu）也在多种恶性肿瘤中发生突变，其中最常见的为乳腺癌。

EGFR获得癌基因特性的机制多种多样，包括建立自分泌和旁分泌生长因子环路，EGFR基因的过表达和（或）扩增，基因缺失和突变使受体成为独立的配体，并在某些条件下激活。有报道认为，EGFR存在5种不同形式的基因缺失突变（v I-vⅤ），EGFRv I的特征为全部细胞内结构域缺失，与v-erbB肿瘤蛋白相似，并使得蛋白条件性激活。EGFRvⅡ突变由一种细胞内结构域83个氨基酸缺失组成，该83个氨基酸本应存在于受体内次级半胱氨酸富集区。有趣的是，该突变没有表现出致癌潜能。在约50%的恶性胶质瘤中存在EGFR扩增现象和基因座外显子2-7的基因内缺失现象，这就形成了外显子1和8的基因融合，引起了受体的节段缺失突变，这属于EGFRvⅢ。EGFRvⅢ等位基因是恶性胶质瘤中最常见的EGFR基因重新排列，并且已被证实能编码独立于配体的条件性激活受体而成为一种强效的致癌基因。最近有研究表明，EGFRvⅢ和野生型EGFR协同促进胶质瘤生长。有报道显示EGFRvⅣ是一种在细胞内酪氨酸激酶结构域远端缺乏内在片段的受体，也是一种强效致癌基因。在胶质母细胞瘤中存在EGFR（EGFRvⅤ）羧基端节段缺失，并且在多种存在EGFRvⅤ突变受体的肿瘤也存在EGFRvⅢ等位基因。最近一项胶质母细胞瘤中该受体的大样本测序研究，揭示了细胞内受体结构域的多种致癌性错义突变，在某些情况下这种突变具有致癌潜能。

第一个运用致癌性ErbB家族成员制备的小鼠肿瘤模型是通过MMTV启动子控制Her2/Neu致癌基因表达完成的。该转基因模型能制备乳腺癌，具有完全的外显率，相对较短的潜伏期以及肿瘤转移潜能。运用这种转基因模型和由此派生的多种更为精确的模型研究乳腺癌，带给我们更多方面的启示。

第一个运用EGFR制备的转基因胶质瘤模型是为了探索少突胶质细胞瘤的发病机理，该模型鼠在S100启动子的控制下表达v-erbB致癌基因，目的是为了在少突胶质细胞和星形细胞处于脑发育早期阶段时表达一种活化的EGFR转化同源体。S100b-v-erbB转基因能使胶质瘤中EGFR高表达。

在S100-v-erbB转基因动物中，20%小鼠产生肿瘤，通过Western blot方法，运用抗磷酸酪氨酸抗体在肿瘤中可以检测到活化的v-erbB表达。转基因表达的区域分布与S100b基因分布相一致。在组织病理学上，低级别人脑少突胶质细胞瘤与其他肿瘤具有多种共同特征，虽然在不到10%的病例中肿瘤与星形细胞瘤相似。研究者认为在这些模型鼠中出现小部分星形细胞瘤是由于EGFR过表达在少突胶质细胞瘤形成过程中为早期事件，而在星形细胞瘤形成过程中是晚期事件。另外也可能是由于星形细胞瘤细胞具有低度转化能力，相反由v-erbB转化的少突胶质细胞具有更好的稳定性。该模型肿瘤潜伏期、外显率和组织病理级别在合并缺失p53基因或者cdkn2a基因后得以大大改善，这表明与TSG（tumor-specific glycoprotein，肿瘤特异性糖蛋白）相关的细胞周期缺失既能促进EGFR致癌性，也能增加肿瘤恶性级别。而Rb1基因缺失对肿瘤外显率、潜伏期和肿瘤级别却几乎没有作用。这可能是由于小鼠肿瘤形成过程中，Rb家族成员p107和p130之间存在补充机制。该模型鼠的不完全外显率和长短不一的潜伏期表明，还存在其他基因事件促进胶质瘤形成。为解决这个问题，研究者针对S100b-v-erbB转基因少突胶质细胞瘤模型进行了比较性基因组杂交（comparative genome hybridization，CGH）实验，并证实了在人脑少突胶质细胞瘤中存在特定直系同源染色体区的获得和缺失，并存在基因复制后的改变，其中包括染色体1p36缺失。目前人脑少突胶质细胞瘤中多数为1p/19q缺失，该模型极为适用于发现与少突胶质细胞肿瘤相关的新基因。

虽然S100b-v-erbB转基因模型证实了在某些合适的细胞中表达活化的EGFR等位基因能产生肿瘤，但是，在运用GFAP启动子控制野生型EGFR和EGFRvⅢ变体时，却不能诱发肿瘤发生。在运用RCAS/TVA反转录病毒系统在神经胶质前体细胞（Nestin阳性细胞）和星形细胞（GFAP阳性细胞）中过表达EGFRvⅢ时，也出现同样的情况。说明EGFR的致瘤能力似乎依赖于细胞内的表达水平和其他基因事件的影响。

小结

虽然运用人胶质瘤细胞系作体外实验研究已经能为我们提供许多可靠的研究结果，但是体外实验存在诸多限制，如无法模拟肿瘤侵袭、血管形成、转移以及细胞微环境对药物的反应等。因此，为了研究肿瘤生物学特性，改进临床前期试验以完善疾病治疗策略，研究者们建立了多种动物模型。这些体内研究模型大致分为两个基本类型：一是肿瘤细胞移植模型，二是自发性肿瘤模型。

肿瘤细胞移植模型可以分为同种异体移植和异种移植，按移植部位又可以分为原位移植和异位移植。传统的同种异体移植模型采用接种组织培养获得的稳定细胞系，由于这种肿瘤源自动物血清培养的肿瘤细胞系，并不能完全表现典型的人脑胶质瘤组织病理特征，并且在临床前期研究中不具备预测性。一项运用临床前肿瘤模型评估31种肿瘤药物细胞毒性的研究显示，同种异体移植模型在Ⅱ期临床试验中的实效性有限。

最近，随着肿瘤干细胞研究的进展，异种移植胶质瘤模型得到明显改进。从原位异种移植模型中认识到了诸多胶质母细胞瘤生物学特性。例如，原位胶质母细胞瘤模型能反映不同细胞种群对各种致癌基因的敏感性。当用肿瘤干细胞培养基培养原代培养的胶质瘤细胞，并原位注射建立模型，相比于用普通的血清培养基培养，更能反映原发肿瘤的表形和基因型。这类肿瘤非常典型地反映出胶质瘤细胞向正常脑组织的侵袭性，但不能表现出人胶质母细胞瘤中的微血管增殖和假性栅栏样坏死现象。这种原位肿瘤模型被应用于研究胶质母细胞瘤肿瘤干细胞的生物学特性，以及重建肿瘤中某些微环境和细胞异质性。

异种移植主要有以下两种争议：一是实验动物缺乏免疫功能；二是接种肿瘤的实验方法。大多数原位异种移植胶质瘤模型是通过将人的胶质瘤细胞注射到免疫缺陷的小鼠颅内实现的，很明显这种肿瘤形成过程缺乏免疫监视，而在具有免疫功能的宿主中，肿瘤形成过程又不具代表性。此外，免疫缺陷小鼠的DNA修复功能受损，使得它们无法接受一些新颖治疗方法（如放疗）。该模型另一个潜在的缺陷是肿瘤的形成是由于向颅内注射一定量的肿瘤细胞，这种肿瘤形成方法与自发性肿瘤形成有很大区别，由于这些争议和基因技术的进展，许多学者转向采用更能代表肿瘤生物学特性的方法建立肿瘤模型。

转基因模型，这种模型与人类疾病具有更好的基因相似度，在肿瘤研究中起着重要的作用。首先，该模型能提供相当一部分致癌基因组学研究资料，能鉴别更多在肿瘤进展过程中发生改变的基因。其次，该模型还用于明确特定基因的致癌性。同时还能利用特定基因突变的工程化小鼠分析协同基因网络、信号通路以及测试药物作用。在过去十年间，转基因胶质瘤模型已广泛应用于分析胶质瘤的发生、发展及侵袭性研究中。虽然此模型能较好地反映人脑胶质瘤的组织病理特征，但是随着基因组学更多地运用到评估肿瘤的分子亚型，对转基因胶质瘤模型提出了更高的要求。未来建立转基因的胶质瘤模型不会仅仅依赖于肿瘤致癌基因的研究，将更多地借鉴神经科学和干细胞生物学领域的研究成果，进一步设计更具保真度而又易于获得的转基因胶质瘤模型，运用于肿瘤研究，尤其是各分子亚型胶质瘤治疗研究。