第二节　HER2的检测方法

自2000年以来，国内的一些医院已经把HER2检测作为新发乳腺癌的常规诊断项目。原位杂交（in-situ hybridization，ISH）被认为是判断HER2状态的最佳检测方法，但免疫组化（immunohistochemistry，IHC）技术因其操作简单、价格低廉，被大多数国内病理机构作为HER2检测的首选方法。

一、免疫组织化学检测方法

免疫组化法操作简便，费用低廉，对材料要求不高，耗时相对短，因此是临床首选的检测方法。但是该方法也存在一定的局限性，例如在标本制备过程中的不当处理会破坏组织的抗原性导致难以恢复原始的表达状态，此外免疫组化结果判断主观性较强。当IHC判读为2+时，必须进行ISH检测以明确HER2状态。

仅介绍采用S-P法检测HER2蛋白的表达。用已知阳性片作为阳性外对照，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性外对照，被检查肿瘤组织切片内的正常乳腺组织作为阴性内对照（尽量选取带有正常乳腺组织的肿瘤蜡块切片进行检测），染色结果用DAB显色。实验步骤如下：

1.载玻片处理 载玻片用肥皂水浸泡过夜，流水冲洗干净，再用95%酒精浸泡过夜，捞出后擦干。然后将洗干净的玻片放入新配制的APES丙酮工作液（1︰50）中停留20～30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干，备用。

2.石蜡包埋的组织块切片，切片厚度为4μm。置于37℃恒温箱过夜，以减少脱片（载玻片提前用多聚赖氨酸浸泡）。

3.石蜡切片常规脱蜡水化。

4.蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟。

5.将切片放入盛有适量枸橼酸抗原修复液的高压锅中，加热至沸腾，喷气2分钟，切片冷却至室温以修复抗原。

6.蒸馏水冲洗，PBS洗2分钟×3次。

7.3% H₂O₂室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。

8.5%～10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟，倾去血清，勿洗。

9.根据说明书滴加单克隆抗体孵育。

10.PBS冲洗，2分钟×3次。

11.滴加生物素标记二抗工作液，37℃湿盒内孵育20分钟。

12.PBS冲洗，2分钟×3次。

13.滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃湿盒内孵育20分钟。

14.PBS冲洗，2分钟×3次。

15.以新鲜配制的0.05% DAB-0.01% H₂O₂（0.05Mol/L，pH 7.6）显色，室温1～10分钟，镜下观察，满意后以蒸馏水充分冲洗终止反应。

16.苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片保存，显微镜下观察。

二、原位杂交检测方法

原位杂交是一种分子细胞遗传学技术，通过荧光或其他染料标记的探针与细胞核内的靶序列杂交。在显微镜下观察细胞核内靶序列的多种彩色探针信号，获得细胞内多条染色体或染色体片段或多种基因状态的信息。荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）和显色原位杂交（chromogenic in situ hybridization，CISH）是当前已获FDA批准的用于检测HER2状态的方法。

FISH技术是采用荧光探针检测系统，通过同时检测HER2基因与17号染色体着丝粒（chromosome 17 centromere，CEP17）拷贝数的情况，评价HER2基因的状况，由于有CEP17信号作为对照，其结果具有比IHC更稳定、重复性高的特点。SFDA批准的Pathvysis探针，是含有HER2基因（标记为橘红色荧光）和该基因所在的17号染色体着丝粒（标记为绿色荧光）序列的混合探针。但其检测结果必须通过荧光显微镜在暗视野下进行观察。

CISH是一种亮视野原位杂交检测HER2基因扩增水平的新方法，其通过肿瘤细胞HER2基因的拷贝数量评估HER2基因状况。CISH使用地高辛标记的探针，其通过鼠抗地高辛-抗体和辣根过氧化物酶-抗鼠抗体进行免疫结合，经DAB显色后，用普通显微镜亮视野观察HER2基因信号。CISH检测可以同时显示基因异常与组织形态学，且检测切片可长期保存。

银增强原位杂交（silver-enhanced in situ hybridization，SISH）与CISH检测相近，其通过二硝基苯（dinitrophenol，DNP）标记的探针检测HER2序列，并利用银染ISH DNP染色液进行显色。用地高辛标记探针检测CEP17，采用地高辛红染显色液进行显色。在光镜下观察结果，其中HER2在肿瘤细胞的细胞核中表现为黑色信号，CEP17为红色信号。