第三节 HER2规范化检测
为了提高HER2检测准确性，2007年美国临床肿瘤学协会（American Society of Clinical Oncology，ASCO）及美国病理医师学院（College of American Pathologists，CAP）联合发布了HER2实验室检测指南（2007年版）；指南对HER2检测提供了指导，但也有一些尚待解决的问题，例如对临界值病例是否治疗、17号染色体非整倍体对结果的影响等。基于以上，2013年ASCO/CAP联合发布了HER2实验室检测新指南（2013年版），新版指南系统性地回顾了HER2检测的相关文献，提出了优化的HER2检测指南，具体解读如下。
一、结 果 判 定
免疫组化方法是乳腺癌患者检测表达初筛最常使用的方法。该方法根据HER2蛋白表达的强度进行评分（共计4个等级：0、1+、2+、3+），其中3+判读为HER2阳性，2+需要行ISH进一步明确结果。
结果判断应注意以下几点：①先低倍镜下观察着色范围，再通过高倍（×10以上）物镜下判读着色程度；②注意细胞膜完全着色的癌细胞比例及着色强度进行判读；③胞质着色忽略不计；④导管内癌（DCIS）的着色应忽略不计，只评定浸润性癌的着色情况；⑤正常乳腺上皮不应着色，当正常上皮着色时应注意假阳性的结果；⑥HER2评分系统如下：0：无染色或≤10%的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色；1+：>10%的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色；2+：有两种情况，第一种为>10%的浸润癌细胞呈现不完整和（或）弱～中等强度的细胞膜染色，第二种为≤10%的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色；3+：>10%的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色。
IHC检测指南的变化：
HER2指南编写组建议对所有浸润性乳腺癌进行HER2状态的检测，提倡将原有的检测结果（阴性、临界值和阳性）简化为两种（阴性及阳性）。我们认为这主要是由于目前尚缺少对临界值病例的处理规范，临床对于该类病例的治疗存在较大的不一致性，因此编写组剔除了临界值，将结果简化为阴性与阳性。对于处在临界值的病例，指南推荐重新检测或者更换蜡块，直至得到明确的结果。
新版指南将HER2阳性的诊断标准修订如下：IHC阳性的标准是>10%的浸润性癌细胞呈现强的而完整的细胞膜棕褐着色（图2-3-1）。对于2＋的病例，应该用FISH或重复IHC做进一步检测，也可以选取不同的组织块重新检测或送中央实验室进行检测。如仍不能确定，则需要进行一定的临床病理沟通以有利于治疗方案的确定。
ISH技术是在DNA水平检测HER2基因，与IHC检测蛋白相比，DNA要更加稳定，其中FISH不仅可以提供HER2基因的扩增状态，还可以检测17号染色体的情况，尤其对于17号染色体多体的检出有重要意义，其对实验结果的判读是基于定性和定量相结合，且结果判断客观。
二、规范化检测的要求
HER2蛋白和基因扩增的检测需结合本实验室的条件且依照规范化的程序操作，以保证结果可靠。实验室内、外部质控和SOP的具体要求如下：①准备开展乳腺癌HER2检测的实验室最好选择1～2家已较好开展乳腺癌HER2检测的实验室进行25～100例标本的对比验证，也可通过进行外部质控活动。外部质控的阳性和阴性结果的一致性应达到95%以上。这类活动每年应进行1～2次。②内部质控工作应包括同一组织不同批次的染色结果的重复性分析，每次染色阳性、阴性对照的设置，如有可能还应设置包括低表达/低扩增对照。检测相关的仪器和设备需定期维护、校验。③应建立完善的标准化操作程序，并做好每次检测情况的记录和存档工作。④任何操作程序和试剂的变化均应重新进行严格的验证。⑤从事乳腺癌HER2检测的实验技术人员和病理医师应进行必要的培训和资格考核。
标本的类型：①新鲜/冷冻标本；②针吸活检标本；③粗针穿刺标本；④手术切除标本。
标本的固定：尽量缩短取材到固定的时间，乳腺癌组织切除后应在1小时内进行良好固定（应将标本每隔5～10mm切开，并可在组织间嵌入纱布或滤纸等物，固定液的量应达到待固定组织量的10倍左右）。固定时间以6～48小时为宜。不宜用微波快速固定组织。目前，乳腺癌粗针穿刺活检病例较多，穿刺组织小有利于快速且良好的固定，但对小组织进行IHC检测时应注意边缘效应和组织挤压的影响所产生假阳性判断。
固定液的类型：4%中性（磷酸缓冲）甲醛固定液（10%中性缓冲甲醛）。
组织切片：①未染色的切片置于室温不宜超过6周，以防抗原丢失。②用于IHC染色者以3～5µm为宜，FISH和CISH法以4～5µm为宜；空气中略微干燥后应立即烤片（IHC：70℃，45～70分钟；FISH：63℃过夜）。③完成检测的切片，IHC和CISH可按常规长期保存，FISH结果应立即照像存档并于-20℃保存1～2年。④三种方法均应有HE染色切片作为对照。
任何操作程序的变更（比如更换检测试剂、抗原修复程序、染色程序或设备）均要求重新验证，达到要求才可使用。采用自动染色程序和设备，并定期仪器维修、校正和保养，有关记录要及时更新和存档。对于IHC检测过程中的抗原修复步骤：要注意到不同热修复方式和不同缓冲液的采用可能产生的染色差异，跟换修复方式是必须经过对比实验，以保证检测结果的可重复性。
另一个重要的因素是抗体选择：不同商业化抗体与抗原亲和力不同，我们建议应结合本实验室的情况，使用已获认证的抗体并严格遵循推荐的实验指导规程进行，包括抗体稀释浓度、抗原修复方式等。每轮测试均使用标准的对照标本，应包括阳性、阴性对照；如果可能，应包括低扩增/低蛋白表达对照。目前在欧美等国已经建立经过标准化且商业化的高质量阳性细胞系作为对照，而在标准化的中心实验室、每张HER2检测切片均添加阳性对照。应用这些对照材料将非常有利于HER2检测准确率的改善。经过多年来HER2标准化、规范化培训，我国大型实验室内部也建立了阳性对照病例体系，并每次使用，减少差异。
不予IHC检测和判读的标准：组织固定于未经过事先验证的非甲醛固定液；固定时间不符合ASCO/CAP标准且未经事先验证的（即粗针活检标本在甲醛中固定不足1小时，切除活检标本在甲醛中固定不足6小时或超过48小时）；粗针活检标本有边缘染色效应或人为造成的组织皱缩或挤压；正常导管或小叶细胞呈强的胞膜染色；对照未出现预期结果；避免分析导管内癌，仅计数浸润导管癌成分。建立质量控制体系：每一批次检测均应设置内、外对照。
免疫组化检测中，癌旁正常乳腺上皮细胞是很好的阴性内对照；ISH检测中，可以使用乳腺组织中的正常细胞（如成纤维细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、正常乳腺上皮细胞）的HER2信号作为内对照。出现下列情况时应视为检测失败，包括：①对照未出现预期结果；②难以观察到至少两个浸润癌区域并计数；③缺乏细胞核内的棕色信号；④严重消化过度或细胞核中空泡干扰计数；⑤非特异性背景染色强，干扰计数。
建议在每次染色过程中都加入阳性和阴性对照（可采用厂家提供的质控对照片），以用于确认试剂质量及检测程序的可靠性。报告中也应体现相应批次实验内、外对照的结果。
（撰写 杨壹羚 钱晓龙 付丽 审稿 付丽）