第四节　肝毒性生物标志物

一、血清酶学相关肝毒性生物标志物
根据国际医学科学组织理事会( the Council for International Organizations of Medical Sciences，CIOMS)的标准分类方法，通常将肝损伤分为肝细胞型、胆汁淤积型和混合型三种。不同的肝毒性生物标志物由于分布不同，其反映的肝损伤类型也不同。下面将从肝细胞毒性、肝胆管毒性和综合性的肝功能毒性三个方面介绍临床前或临床上使用血清酶学检验技术开展肝毒性生物标志物的研究情况。

(一)肝细胞毒性相关生物标志物 1.丙氨酸氨基转移酶( alanine aminotranferase，ALT)

血清ALT活性水平是目前评价肝毒性最常用的临床生化检测指标。ALT在氨基酸代谢和糖异生具有重要的作用。ALT主要分布于肝脏，在骨骼肌和心脏也有少量分布。当肝细胞损伤时，肝脏细胞内大量的ALT漏出进入血液，因此血清ALT的活性能反映肝细胞的损伤程度。尽管骨骼肌和心脏损伤也能引起ALT的升高，但ALT仍然是目前广泛接受和使用的肝毒性生物标志物，并被视为肝脏损伤临床生化检测的“金标准”。2009年7月29日，美国FDA颁布了“行业指导原则:药物引起的肝损伤:上市前临床评价”，其中ALT仍然被推荐作为鉴别药物引起肝损伤的关键生物标志物。当患者服用可能引起肝损伤的药物时，推荐临床上定期监测血清ALT，以降低肝损伤风险。由于ALT的半衰期较长(在犬、大鼠和猴中约40～60小时)，使用ALT评价急性和亚急性肝损伤比AST等其他指标更有优势。
ALT虽然具有足够的灵敏度但是缺乏特异性，因此为了改进ALT的特异性，近年来建立了多种同工酶特异性检测方法来研究ALT同工酶( ALT1和ALT2)活性差别。在四氯化碳( carbon tetrachloride，CCl 4)和对乙酰氨基酚( acetaminophen，APAP)诱导的大鼠肝毒性模型中，采用实时定量PCR方法研究ALT1和ALT2的mRNA分布表达情况，结果发现ALT1主要在下列组织表达(表达水平由高到低排列) :小肠、肝脏、脂肪组织、结肠、肌肉和心脏，而ALT2主要局限于肝脏、肌肉、脑和白色脂肪组织。ALT同工酶在亚细胞水平的分布区别在于，ALT1是胞浆蛋白，而ALT2是线粒体蛋白，因此ALT2升高反映的是线粒体损伤。Miyazaki等使用免疫印记、LC-MS/MS技术研究Beagle犬ALT同工酶的活性，结果发现，在肝脏中仅检测到ALT1，在骨骼肌中检测到ALT1和ALT2，表达水平为:肝ALT1＞骨骼肌ALT1＞骨骼肌ALT2;血清ALT1是引起总血清ALT升高的主要因素。
此外，研究发现一些药物能诱导或抑制ALT1和ALT2的表达，导致ALT检测结果的假阳性或假阴性。例如，非诺贝特( fenofibrate)能通过激活启动子显著增加ALT1的基因表达，但并不引起肝损伤;微囊藻素-LR能抑制ALT基因的表达，降低ALT活性，在大鼠出现明显肝损伤时，ALT水平仍然在正常范围内。
目前，ALT1还是ALT2更有可能成为肝毒性潜在的生物标志物，还有待于进一步的研究。但是在药物研发中，使用特异性更高的新的肝毒性生物标志物和ALT结合起来将能更准确地评价药物的肝毒性。

2.天冬氨酸氨基转移酶( aspartate aminotransferase，AST)

与ALT的原理相似，AST也是业内被广泛认可的标准肝毒性生物标志物之一。AST主要分布于肝脏、心脏、脑和骨骼肌。当肝脏外组织损伤时(尤其是骨骼肌损伤)或红细胞溶血时也会引起AST显著增加，因此AST检测肝毒性的特异性要低于ALT。在临床研究中，血清AST和ALT活性的比值可以用于区分肝损伤和其他器官损伤，也可用于诊断急性酒精性肝炎和肝硬化。例如，当ALT明显升高且AST/ALT＞1时，则表明有肝实质损伤。但是在许多慢性肝脏疾病中，如肝炎，ALT水平高于AST;因运动过度引起肌肉损伤的患者中，AST与ALT的比值甚至会超过3∶1。
目前，至少已有两种AST同工酶被发现，一种是存在于细胞质内的AST( cAST)，一种是存在于线粒体内的AST( mAST)。临床研究发现，当人摄入乙醇时血清mAST峰会迅速出现，这表明血清mAST可作为急性乙醇摄入的潜在生物标志物。在临床前研究中发现，大鼠中80% AST是mAST，而在犬中40% AST是mAST，因此使用大鼠进行临床前研究只有在相对严重的肝坏死时AST才会显著增加。然而，目前cAST和mAST与血清AST的关系以及AST同工酶是否容易受药物诱导或抑制仍不清楚，AST同工酶分析方法还需要进一步完善。

3.山梨醇脱氢酶( sorbitol dehydrogenase，SDH)

SDH是一种能催化山梨醇、果糖和还原型辅酶( NADH)发生可逆性氧化还原反应的血清酶。在全身各个组织中广泛分布，但主要集中在肝脏、肾脏和精囊组织细胞的胞浆和线粒体中。在急性肝损伤时，血清SDH水平会迅速增高(半衰期＜12小时)，在48～72小时恢复到正常水平。不同实验室报道的SDH酶稳定性略有差异，但将血清冻存至少可以稳定保存3天。
临床前研究发现，SDH在多个动物种属的肝脏内均具有很高的活性，可以作为肝毒性的生物标志物。例如，Jackson等使用SD大鼠研究地塞米松( DEXA)的肝脏毒性，单次给药后第16小时给药组动物血清SDH与对照组相比升高4. 6倍，连续4天给药后下降为2. 5倍。Seefeld等使用恒河猴研究TCDD对肝功能的影响，结果发现所有TCDD给药组动物的血清SDH和ALT活性均明显增加，组织病理学检查发现肝细胞脂肪浸润和轻度坏死。在杀扑磷( methidathion) Beagle犬毒性研究中，血清生化统计结果显示中、高剂量组动物血清胆汁酸明显增加，ALT、SDH和ALP中度增加。由此可见，SDH在多个动物种属均有活性，水平也和其他肝血清酶活性相当。血清SDH的活性能否对ALT的预测作用有所帮助，还需要更多的试验研究证明。但是可以肯定，对于使用缺少ALT的动物品系评价肝毒性时，SDH有较好的预测价值。

4.谷氨酸脱氢酶( glutamate dehydrogenase，GLDH)

GLDH是最近提出来的有较好应用前景的肝毒性生物标志物之一。与其他生物标志物相比，GLDH有三个优势:①分布特异性:在人体中，GLDH仅分布于肝脏(尽管在脑内也有GLDH同工酶的存在) ;在大鼠中，GLDH主要位于肝脏，极少量分布肾脏，血清GLDH活性基本全部来自肝脏。②GLDH不易受到药物抑制和诱导影响，能准确反映肝损伤: O’Brien等使用了多种肝损伤大鼠模型(如部分肝切除术，给予肝毒性化合物:噻吩甲吡胺、地塞米松、环丙孕酮、异烟肼、硝酸铅和Wyeth-14643)，比较了ALT、GLDH、AST、SDH和ALP的血浆活性。与转氨酶不同，GLDH的活性不会受到能够影响吡哆醛-5’-磷酸的药物(如异烟肼和铅)的抑制，因此血清GLDH活性比肝转氨酶更有肝脏特异性，也不受骨骼肌损伤的影响。此外血清ALT活性能够被环丙孕酮和地塞米松所诱导，而GLDH则不能。③灵敏度高，半衰期较长(约16小时) :在O’Brien的研究中，与血浆ALT增加相比，GLDH升高幅度更大(高达10倍以上)，持续时间更长。
然而，目前GLDH研究中也发现了许多问题。例如，在APAP肝毒性小鼠模型中，GLDH能被APAP代谢产物的共价结合物明显抑制。因此，如果在该模型中仅使用GLDH进行预测，就会低估药物引起肝毒性的严重程度。还有研究表明，GLDH容易发生翻译后修饰，例如酪氨酸硝化或蛋白氧化，这也是药物引起肝损伤的共同机制之一，有多篇文献报道可能会引起酶的抑制或失活。此外，GLDH是一个典型的变构酶，目前已发现有许多变构激活剂和抑制剂能够调节其催化活性。因此使用GLDH进行肝毒性预测前，应尽可能地排除酶本身的变构属性或变构调节因子的影响。Lee等在大鼠肝脏内发现了线粒体GLDH和内质网GLDH，但这两种同工酶与肝毒性检测之间的关系还有待于进一步研究。随着越来越多的GLDH商品化检测试剂盒的供应，可以开展更多比较和评价研究，验证其作为肝毒性生物标志物的能力。

5.谷胱甘肽S-转移酶α( glutathione S-transferase alpha，GSTα)

谷胱甘肽S-转移酶( GST)是一种多功能药物代谢酶，目前发现GST有多种同工酶，如GSTα、GSTμ、GSTπ、GSTθ等，其中GSTα主要在肝细胞表达，大概占可溶性蛋白的5%。与ALT和AST不同，GSTα主要位于肝小叶中心细胞，因此对肝脏代谢区的损伤更加灵敏。
在临床研究中，9名过量服用APAP的患者均检测到GSTα的异常升高，其中6名患者GSTα的水平增加了2倍以上。在临床前研究中，大鼠单次口服给予α-萘基异硫氰酸酯( ANIT)、溴化苯( BrB)和硫代乙酰胺( TAA)，结果发现各给药组动物的GSTα水平与对照组相比都升高了约4倍，升高幅度大于ALT和AST。在CCl 4大鼠肝毒性临床前研究中，与AST相比，GSTα出现时间更早，灵敏度更高，在较低程度肝损伤时就会快速释放。在肝损伤停药后，GSTα能够快速地恢复到正常水平，这表明GSTα还可以作为肝毒性恢复评价的生物标志物。尽管与肝脏其他酶学指标相比，GSTα的分布特异性还没有完全评估，但有试验表明GSTα仅限于肝脏和肾脏表达，而且肾脏损伤仅引起尿中GSTα的增加，并不能引起血清GSTα的增加，因此GSTα对于肝损伤具有很好的特异性。在丙戊酸( VPA)毒性研究中，由于丙戊酸单次给药能够引起溶血，干扰了血清ALT和AST活性检测，因此使用GSTα评价丙戊酸引起的肝毒性。大鼠每天一次腹腔注射500mg/kg丙戊酸，分别连续注射2、4、7、10和14天，结果发现，给药4天后GSTα水平明显增加，与组织病理学检查结果(肝坏死、脂肪变性等)一致。
此外，Rees等研究发现肌肉坏死时并不引起GSTα水平的变化，这表明GSTα可以用来区分肝损伤和肌肉损伤。如果对照组GSTα水平较低，给药组GSTα水平较高并伴有肝坏死，这对于解释肝损伤引起的转氨酶升高很有帮助。

6.乳酸脱氢酶( lactate dehydrogenase，LDH)

目前，已发现5种LDH同工酶，但仅有LDH-5可以考虑作为肝毒性评价的指标。LDH-1是心脏毒性常用的生物标志物。由于缺乏特异性和检测技术问题，血清LDH的活性很少用作肝毒性的生物标志物。然而，在体外肝细胞毒性试验中，LDH是一个普遍使用的标准方法用以评价药物能否引起肝损伤。当细胞死亡时，细胞内的LDH会释放进入培养基内，比较培养基内的LDH的活性与细胞100%死亡时(通常加入细胞裂解液)全部释放的LDH活性，可以用于评价细胞活力。肝细胞的细胞毒性也是体外预测药物能否引起肝损伤的一个重要指标。值得注意的是尽管LDH可以作为细胞死亡的体外生物标志物，但是它并不能区分凋亡和死亡。最近研究发现，绿茶提取物的一种成分能显著抑制LDH活性，如果此时使用LDH将无法准确预测和评价肝毒性。因此，需要先进行预试验，然后再决定LDH是否能作为体外肝毒性预测的生物标志物。

(二)肝胆管毒性评价相关生物标志物 1.碱性磷酸酶( alkaline phosphatase，ALP)

ALP是肝胆管效应和胆汁淤积的主要标志物。ALP的独特优势在于，与其他肝毒性生物标志物一起，至少能够部分地预测胆管阻塞性肝损伤，并与组织病理学结果相一致。根据国际医学科学组织理事会( CIOMS)制定的药物性肝损伤分类标准，ALP大于两倍以上，或者ALT/ALP比值不超过2，即可判断为胆汁淤积型肝损伤。临床研究发现，在人原发性胆汁性肝硬化中，血清ALP的活性甚至可增加20倍以上。在人体中，ALP的水平和药物诱导的胆汁淤积具有很好的相关性。临床前研究发现，大鼠进食能引起血清ALP迅速升高，干扰检测结果的准确性，因此使用γ-GT预测大鼠的胆汁淤积比ALP更加可靠。
此外，在人和动物的肝脏、骨骼、肾脏和胎盘等组织中也发现了多种ALP的同工酶，因此，除了药物引起的肝损伤以外，其他因素如骨骼病变和怀孕等也能够引起ALP的增加。因此，ALP本身不能作为胆汁淤积型肝损伤特异的生物标志物，必须与ALT和AST联合起来共同评价肝毒性。

2.γ-谷氨酰转移酶( gamma glutamyl transferase，γ-GT)

γ-GT主要分布于肝脏、肾脏和胰腺等组织，其中肝脏内的γ-GT含量低于肾脏。血清γ-GT活性是肝胆管损伤的重要标志，特别是对胆汁淤积和胆管损伤具有很高的灵敏度，但特异性较低。临床研究发现胰腺炎、心肌损伤或乙醇滥用均能引起γ-GT的升高。在临床前研究中，大鼠γ-GT的表达具有组织特异性，当大鼠胆管增生或坏死时会引起血清γ-GT显著增加;犬血清γ-GT作为胆汁淤积的生物标志物虽然灵敏度相对较低但特异性非常高;而猴血清γ-GT的灵敏度和特异性均明显高于ALP。此外，部分药物也能够诱导γ-GT的增加，例如犬给予泼尼松后能引起γ-GT增加，但是不会引起胆汁淤积或胆管增生。

3. 5’-核苷酸酶( 5’-nucleotidase，5’-NT)

5’-NT是一种催化核苷酸分子中磷酸链水解的特异性磷酸酶，广泛分布在肝、胆、胰、肠、心、脑等脏器和组织的细胞膜上，在肝内主要存在于胆小管和窦状间隙内。临床研究发现，释放入血液循环中的5’-NT主要来源于肝胆组织。5’-NT活性增高常见于胆管癌，胆道阻塞，胆管炎，急、慢性肝炎等，其活性增高可达2～6倍，且与病情严重程度呈正相关。与ALP不同，5’-NT特异性高，不受骨骼生长和骨骼类疾病的影响，因此能协助判断ALP增加是肝胆系统疾病还是骨髓系统疾病。5’-NT还有助于鉴别诊断肝细胞性黄疸和阻塞性黄疸，后者5’-NT明显高于前者。在临床前研究中，Pagani等发现大鼠5’-NT作为胆汁淤积的生物标志物在灵敏度和特异性方面均优于ALP 和γ-GT。但是于目前缺乏方便使用的检测试剂盒，限制了其在临床前研究中的应用。

(三)肝功能评价相关生物标志物 1.总胆红素( total bilirubin，TB)

胆红素是血红素分解代谢的产物。TB由间接胆红素和直接胆红素组成。通常血清TB增加并伴随血清ALT/AST增加，表明肝脏从血浆清除胆红素的整体能力受损，可以预测严重的肝毒性反应。TB是临床上广泛应用的诊断性肝毒性生物标志物，由于只有肝脏才能清除血液中的胆红素，因此TB具有较强的特异性。与ALT、AST和ALP相比，TB能直接反映肝脏的整体功能。临床研究发现，在人急性肝损伤时，TB与病变严重程度的相关性要好于ALT。然而，TB也不是完全的肝毒性特异性生物标志物，当血液性疾病、红细胞溶血或结合能力受损或其他条件下也能引起血清TB的增加。在常规检测中，间接胆红素与直接胆红素的比较分析与TB相比并不能提供更多的信息，因此测定结合胆红素和游离胆红素比例无太大实际意义。

2.血清胆汁酸( serum bile acids，SBA)

胆汁酸是胆固醇在肝脏中降解的代谢产物，也是胆汁的重要成分，在脂肪代谢中起着重要作用。胆汁酸主要存在于肠肝循环系统，只有一少部分胆汁酸进入外周血液循环。总胆汁酸涉及多种信号转导通路，在肝损伤或肝功能改变时可以检测到总胆汁酸的变化。临床研究发现，在发生急性肝炎时，患者SBA浓度急剧升高。通常情况下，发病初期迅速升高并达到峰值的SBA几乎与AST同时恢复正常水平。但与其他临床检验指标相比，SBA水平恢复至正常进程比较缓慢，呈渐进状态。研究发现，SBA的定量测定可作为检测胆汁淤积的一种灵敏、特异的方法。如当发生肝外胆汁阻塞时，SBA浓度显著升高;大多数肝内胆汁淤积患者，如急性肝炎、初级胆汁性肝硬化、妊娠性胆汁淤积，SBA浓度也明显升高。
饮食或禁食也能影响SBA的水平，如进餐消化后1～2小时内SBA水平比空腹时大约高出两倍左右。此外，还有研究表明SBA的测定，对于检测肝细胞毒性药物、急性中毒患者的肝损伤以及跟踪检测此类患者的肝功能均具有重要价值。

(四)新的肝毒性生物标志物 1.精氨酸酶( arginase，ARG)

ARG是一种能够催化精氨酸生成尿素和鸟氨酸的水解酶。与其他肝脏酶相比，ARG1具有更高的肝脏特异性，可能成为一个潜在的生物标志物。临床研究发现，在人肝脏移植后，缺血再灌注损伤、药物毒性(免疫抑制剂和抗生素)和移植排斥反应均能够影响移植肝功能。在这种情况下，ARG1与传统血清标志物相比具有更高的肝脏特异性。肝移植后第1天，血清ARG1达到高峰，然后迅速降低，并与血清AST和ALT活性具有很强的相关性。
在临床前研究中，使用TAA诱导大鼠急性和慢性肝损伤，分别测定ARG1、AST和ALT活性以及病理学改变，结果发现在所有检测酶中，ARG1出现时间最早，增加的幅度最大。但是，目前用于临床前ARG1评价的方法和报道仍然很少，因此ARG1能否成为肝毒性生物标志物还需要通过大量的工作进行验证。

2.血清F蛋白( serum F protein)

又名4-羟基苯丙酮酸双加氧酶( 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPD)，是一种44kDa的蛋白质，主要在肝脏产生，也有少部分在肾脏产生，在正常人体血液中含量很低，是酪氨酸代谢的关键酶。临床研究发现，肝细胞损伤的患者血清中F蛋白含量的增加非常明显。在87名肝病患者中，92%出现血清F蛋白的增加。与传统的肝功能评价指标AST、ALP和γ-GT相比，血清F蛋白具有更好的灵敏度和特异性，并与肝损伤的组织病理学评价有更好的相关性( r=0. 86， P＜0. 001)。在卡马西平( CBZ)、苯妥英钠( PHT)和丙戊酸钠( VPA)给药治疗的患者中检测血清F蛋白，发现血清F蛋白分别增加6%、22%和13%。VPA给药组血清F蛋白的增加，并与γ-GT或AST无关，进一步表明血清F蛋白可以作为伴随抗惊厥治疗的肝细胞功能异常的生物标志物。
尽管血清F蛋白在哺乳动物中广泛存在，但它与肝组织病理学改变的相关性还没有在临床前动物模型中完全阐明。目前也没有检测血清F蛋白的商用试剂盒，只能采用RIA或ELISA检测方法，这也在一定程度上限制了血清F蛋白的研究，但血清F蛋白仍然是一个潜在的有价值的生物标志物。此外，由于大多数的血清F蛋白的工作都是由一个实验室完成，因此还需要更多实验室的验证。

3.苹果酸脱氢酶( malate dehydrogenase，MDH)

MDH是柠檬酸循环中的一种酶，利用NAD +可逆性催化苹果酸生成草酰乙酸。研究显示MDH有10%分布在线粒体，90%分布在线粒体外的胞浆中。一般来说，血清中检测到的MDH酶活性主要来自线粒体外，但是当发生严重细胞损伤时，也可在血清中检测到线粒体内的MDH。肝脏的胞浆MDH活性最大，其次是心脏、骨骼肌和脑。MDH与ALT一样，当组织损伤时才释放到血清中。血清MDH活性主要与肝脏和心脏损伤有关。
在临床研究中，Kawai and Hosaki发现MDH活性测定评估肝损伤的严重程度比AST更有意义，Misra等报道肝硬化患者血清中的MDH活性远高于非肝硬化患者。在临床前研究中，Zieve等使用MDH活性评价APAP引起的大鼠肝损伤，并与组织病理学检查结果(肝坏死)相一致。Korsrud等报道，动物给予硫代乙酰胺、二甲基亚硝胺和二乙醇胺后，MDH活性的增加还和形态学变化具有一定相关性。

4.嘌呤核苷磷酸酶( purine nucleoside phosphatase，PNP)

PNP是嘌呤补救合成途径的关键酶。它可逆地催化核苷酸发生磷酸解，生成各自的碱基和相应的1-(脱氧) -核糖-磷酸。PNP在哺乳动物组织广泛分布，大鼠肝脏中的PNP的平均活性是9. 4U/g，远高于心脏( 0. 18U/g)和肌肉( 0. 59U/g)。PNP主要位于血管内皮细胞、库普弗细胞和肝细胞的细胞质中，在肝脏坏死时释放到肝血窦中。在临床前研究中，Ohuchi等发现大鼠给予半乳糖胺后能引起血清PNP增加，Mochida等发现大鼠给予内毒素引起细胞坏死，血清PNP升高出现的时间要早于ALT。Fukuda等利用PNP活性结合谷氨酰胺转氨酶，共同评估肝窦内皮细胞的损伤。因此，PNP可以成为潜在的肝毒性生物标志物，但PNP临床研究报道较少，还需要开展更多的临床验证工作。

5.对氧磷酶( paraoxonase-1，PON1)

PON1是一种高密度脂蛋白( HDL)相关酯酶，负责肝脏的有机磷解毒和保护低密度脂蛋白免受氧化修饰。与MDH和PNP不同，PON1不是漏出酶，而是和高密度脂蛋白结合起来释放到血液中。PON1绝大部分在肝脏产生，在肾、脑、肺等其他组织也可以检测到PON1活性。血清PON1的减少是肝损伤的标志，其机制可能涉及PON1的合成减少，或者肝脏PON1表达下降继而引起肝脏分泌减少。PON1活性下降与一系列疾病有关，如动脉粥样硬化、血管炎和慢性肝损伤。因此，PON1活性与肝损伤的特异性不是很高。然而，对于使用多个生物标志物进行联合预测，下调生物标志物具有很高的应用价值。Meneses-Lorente等使用蛋白质组学方法也证明了PON1活性可以作为肝损伤潜在的生物标志物。

6.血清药物-蛋白加合物

免疫性损伤是药物引起肝毒性的主要机制之一，主要是由于反复接触药物或其他物质后，与体内蛋白质结合形成药物-蛋白质加合物，激活免疫系统反应，损伤肝细胞膜。例如，在美国，约50%的急性肝损伤是由于APAP过量引起。大剂量的APAP超出了正常代谢途径的负荷，多余的APAP主要由细胞色素P450 2E1代谢生成乙酰苯醌亚胺( NAPQI)，在谷胱甘肽耗竭后，选择性地与肝蛋白结合，形成APAP-蛋白加合物，在大范围肝损伤后，释放进入血液中。大量试验证明，检测血清中的APAP-蛋白加合物能够有效地确定和诊断APAP引起的肝损伤。近年来，已建立了高灵敏度的血清APAP-蛋白加合物的定量检测方法，这些加合物的血液学水平和其他肝毒性生物标志物(如ALT和AST)具有很好的相关性，增加了其作为APAP诱导的肝毒性的新的诊断生物标志物的可能性。血清药物-蛋白加合物作为肝毒性生物标志物的一个独特优势是有利于开展肝毒性病因学研究。
在其他能引起肝毒性药物中，也有药物-蛋白加合物的报道，如双氯芬酸，但是该加合物主要集中在肝脏而不是在外周血中。因此，血清药物-蛋白加合物作为肝毒性诊断的生物标志物还需要进一步验证。

7. T-激肽原( thiostatin)

thiostatin是一种大鼠特异性表达的56kDa糖蛋白和主要急性期反应蛋白，主要在肝脏中合成，在急性炎症反应时(如内毒素血症)释放进入血浆。最近，在EMD335823和BI-3大鼠肝胆管损伤的蛋白质表达谱研究中发现thiostatin显著增加。因此，Adler等使用雄性Wistar大鼠分别给予肝毒性化合物BAY16、EMD335823和BI-3，开展PON1、thiostatin、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白( NGAL)和簇蛋白( clusterin)与传统肝毒性评价指标的比较研究。结果发现血清thiostatin明显增加并伴随靶器官thiostatin转录率增加，与组织病理学变化一致。使用ROC( receiver-operating characteristics)分析结果显示，血清thiostatin作为肝胆管损伤的标志物比传统生化指标ALP、ALT和AST更加灵敏。值得注意的是，除肝损伤外，其他组织损伤(如肾损伤)也能够引起thiostatin的增加。此外，由于thiostatin仅在大鼠中存在，在人体中至今未见thiostatin的文献报道，因此该指标无法应用于临床。目前，对thiostatin研究仍然太少，thiostatin作为大鼠临床前研究的潜在肝毒性生物标志物，其灵敏度和特异性还需要更多的试验验证。但考虑到thiostatin反应的灵敏度，在临床前研究中将thiostatin和其他特异性肝毒性指标联合起来将能够增加肝毒性评价的可靠性。
二、组学技术相关肝毒性生物标志物
毒理基因组学的快速发展为毒理学结果的预测提供了新的技术手段，通过对基因组的组成(基因组学)、基因表达(转录组学)、蛋白水平(蛋白质组学)或代谢组分(代谢组学)的研究，有利于阐明毒性机制，发现新的毒性生物标志物，提高对未知化合物的毒性预测能力、不同种属间的预测能力，以及体外试验预测体内试验能力。因此，以下将从基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学四个方面总结肝毒性生物标志物的最新研究进展情况。

(一)基因组学

在过去几年里，人们使用基因芯片开展了大量的肝毒性基因表达谱的研究。一个独立的基因表达谱可能会涉及成千上万的个体基因，因此，相似的肝毒性药物或相似的肝毒性反应，其基因表达谱的改变可能会有一定的相似性。这些显著性差异表达基因如果用作生物标志物，不仅可以预测肝毒性的损伤程度或发生率，还可以解释药物引起肝毒性的机制。
目前，国内外已开展了大量的肝毒性相关基因芯片研究，并获得了许多的肝毒性标志基因。例如，McMillian等使用大鼠模型先后研究了肝毒性药物双硫仑、4-甲基噻唑、炔雌醇和尼美舒利引起的多种氧化应激反应，获得了25～100个基因可以作为肝毒性预测的生物标志物，目前已成功地用于100多个化合物的肝毒性预测。Kiyosawa等使用两种谷胱甘肽耗竭模型研究大鼠肝毒性基因表达谱的变化，结果在丁硫氨酸-亚砜亚胺谷胱甘肽耗竭模型和酶催化谷胱甘肽结合模型中分别检测到69个和161个肝脏差异表达基因，这些基因已在APAP、氯贝丁酯和苯巴比妥引起的谷胱甘肽扰乱试验中得到验证。Sawada等使用体外HepG2细胞模型，获得17个基因可以作为生物标志物预测肝脏磷脂质病，几年后这些基因得到了其他实验室的验证。此外，Bushel等使用APAP诱导的大鼠肝毒性模型，在血液样本中检测到248个基因可以用于肝损伤的预测，由于基因生物标志物在血液中可能比ALT和AST出现得更早，因此，肝毒性的基因生物标识物可能具有更高的临床预测价值。
然而，目前几乎大部分新提出的肝毒性生物标志物主要来自动物试验，都还没有在临床试验中得到广泛验证。因此，目前他们仅在药物研发的临床前研究中具有较大的应用价值。

(二)转录组学

研究发现，不同的肝毒性物质在啮齿类动物中能产生不同的mRNA的转录形式，由此可以推测在人体中可能也是如此。由于使用肝脏活检组织研究生物标志物困难较大，因此人们还是优先考虑能否从血液中发现一些药物特异性的转录表达改变。目前，已初步建立了一种替代方法来检测在肝损伤过程中的全血转录组。在啮齿类动物试验中，使用全血转录组的变化作为生物标志物预测肝毒性，其灵敏度和特异性均优于血清ALT。同样，在APAP诱导的肝损伤患者全血中也检测到转录变化。但是全血转录组主要反映的是淋巴细胞，而肝脏和淋巴细胞转录组的关系目前还不清楚。比较有意义的是，在肝损伤时，在脱细胞处理的血浆中检测到了肝脏来源的mRNA，包括微RNA和mRNA。尽管血浆样本和全肝转录组的关系还有待进一步测定，但是从血液样本中监测人肝脏转录组的变化可能会带来诊断方法学上的一次革命，这将是一个非常有前景的研究领域。
微RNA ( microRNA，miRNA) : miRNA是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由21～25个核苷酸组成。这些小的miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过抑制翻译水平或断裂靶标mRNA调节基因表达。自从1993年发现以来，大量的试验研究证明miRNA是各种来源的癌症的良好的生物标志物。近年来，有研究小组开始研究血液循环中的miRNA能否作为肝毒性的新型生物标志物。在D-半乳糖胺和APAP大鼠急性毒性模型以及两种大鼠肝纤维化模型中，发现肝脏来源的miRNA在肝脏损伤后能够释放进入血液循环，可作为潜在的肝毒性生物标志物。在这些模型中，血液循环中的miRNA，例如miR-192和miR-122，比ALT和AST更加可靠、重复性强、易于检测。近年来，还有试验表明，血液循环中的微RNA——miR-122，能够有效地将肝脏损伤与脑损伤和肌肉等肝脏外损伤区分开来。这些结果表明，在肝毒性早期检测中，miRNA与标准的ALT和AST相比灵敏度和特异性更好。这还需要进一步的研究证明。

(三)蛋白质组学

蛋白质组学技术能够快速鉴别和定量分析血清中成千上万的蛋白质，结合统计学分析工具，为研究和鉴定可作为肝毒性生物标志物的蛋白质谱提供了可能。目前，国际上已有多篇使用蛋白质组学技术寻找和肝毒性有关的血清蛋白质的报道。例如，细胞因子就是使用这种方式发现的新的蛋白质生物标志物。此外，在APAP、ANIT和苯巴比妥等化合物诱导的SD大鼠肝毒性模型中，Amacher等使用双向凝胶电泳技术分离血清和肝脏组织蛋白质，然后使用质谱技术进行蛋白质鉴定，结果共发现六种肝脏来源的蛋白可以作为肝毒性的潜在生物标志物，分别为:维生素D结合蛋白、对氧磷酶、细胞视黄醇结合蛋白、MDH、F蛋白和PNP。但是，目前这些生物标志物仅在少量的肝毒性药物中得到了验证，能否作为新的肝毒性生物标志物还需要通过更多的试验验证。
许多细胞因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6，在肝毒性发病机制中发挥着关键的调节作用。肝损伤发生后，肝脏或肝脏外来源的细胞因子会释放进入血液中。在APAP大剂量暴露的小鼠模型中，发现血清细胞因子TNF-α和IFN-g明显增加，并且这些细胞因子作为肝毒性生物标志物已用于肝功能的监测和评估治疗效果。最近在临床上也有文献报道，血清可溶性Fas和HGF作为生物标志物可用于诊断APAP诱导的急性肝脏衰竭。值得注意的是，在非APAP诱导的急性肝脏衰竭中，血清细胞因子(例如TNF-α和可溶性Fas配体)也能够作为潜在的生物标志物进行病情预测。
除了细胞因子水平的变化外，细胞因子的基因多态性检测也已经被证明可以作为肝毒性的生物标志物。在他克林( tacrine)诱导的大鼠肝损伤模型中，发现IL-6的多态性是一种诱病因素，该发现在69名患者身上得到了进一步验证，其中有37名患者出现了他克林诱导的肝损伤。在72名服用双氯芬酸( diclofenac)的患者中，IL-4和IL-10的多态性联合起来也能够预测双氯芬酸诱导的肝损伤。然而，也有其他试验表明IL-10的多态性与IL-4和TNF-α一样，与肝毒性的风险无关。因此，细胞因子多态性能否作为肝毒性生物标志物还需要进一步研究。

(四)代谢组学

代谢组学研究的主要目的是研究和揭示小分子代谢产物图谱及其在某一器官或整个机体的特定细胞过程中的作用。随着代谢组学技术的广泛应用，通过肝毒性动物模型，在血清样本或尿样中已经鉴定了越来越多的肝毒性生物标志物。例如，在APAP诱导的大鼠肝毒性模型研究种，发现血清视晶酸( ophthalmate)是肝脏谷胱甘肽耗竭或氧化应激反应的非常灵敏的生物标志物。在丙戊酸大鼠肝毒性模型研究中，使用气相色谱-质谱联用技术检测到尿样中8-羟基-2’-脱氧鸟苷和辛酰肉碱( octanoylcarnitine)显著性变化，可作为新的肝毒性生物标志物。这些非侵入性的代谢组学研究方法具有独特的优势，然而，与其他组学技术鉴定的生物标志物一样，这些以推测机制为基础的生物标志物还需要广泛的生物学资格验证。
目前，新肝毒性生物标志物研究已取得了很大进步。例如，同工酶特异性检测方法的建立能够改善肝毒性检测的灵敏度，miRNA作为肝毒性生物标志物具有很好的应用前景，组学技术为肝毒性研究带来了更多的候选生物标志物等。但目前肝毒性生物标志物的研究中仍存在许多问题:①目前发现的肝毒性生物标志物仍缺乏足够的灵敏度和特异性。由于大多数生物标志物均存在种属差异、组织分布、半衰期、作用机制等多方面差异，因此使用多个肝毒性生物标志物联合评价( biomarker panels)仍然是目前比较现实的做法，例如将ALT、GLDH和GSTα三者联合评价能相互弥补各自缺点，显著提高整体的灵敏度和特异性。②前面所提到的新的肝毒性生物标志物均没有得到广泛验证，这也限制了它们的应用范围，目前最多只能作为补充性的生物标志物。③如何将临床前研究中的生物标志物应用于临床也是整个毒理学研究领域的一大难题，还需要开展大量的研究工作。希望在将来，随着组学技术的发展和临床检验技术的完善，发现和验证更多的能在早期阶段准确预测肝毒性的生物标志物，更好地应用于临床研究。

(耿兴超　李波)

上一章目录下一章