呼吸系统是机体与环境之间的主要接触部位，雾化吸入、滴鼻以及其他途径给药都可能导致呼吸系统的毒副反应。研究药物及不同给药途径对呼吸系统的影响及作用机制，是毒理学的重要内容之一。

将动物放入含有一定浓度药物的空气环境中，使动物吸入一定浓度的药物。总的要求是:在试验期间给药容器中的药物浓度要相对稳定;药物在容器内的分布要均匀;取放动物方便;有足够的容积;便于观察动物的反应;易于清除毒物，保持清洁等。常用的吸入给药方法有静式吸入和动式吸入。气雾剂、喷雾剂和吸入粉雾剂等可以经呼吸道吸入给药观察药物对动物的毒性反应。

经典吸入给药的呼吸毒理学研究方法可以运用于经口服给药的呼吸毒理学研究，但对于吸入或鼻腔内给药的受试药物，应该进行经特定部位给药的毒性试验，主要目的是研究其局部毒性以及通过局部吸收可能导致的全身毒性反应。

在经鼻暴露过程中，动物暴露于暴露塔中的受试物中。为获得最理想的动物暴露，系统供气量和抽出的空气量之间应维持轻度的正平衡。吸入室需处在化学通风橱内。通风橱维持轻微负压即可防止受试物泄漏到附近区域。在试验气流形成时，需要避免任何对动态气流的显著干扰。

经头/鼻暴露系统在大型动物吸入毒理学研究中也得到成功的应用，例如犬类。这种暴露方法的特殊优势是，随时程变化，可以通过单个犬暴露前、暴露中和暴露后的重复采集血样监测暴露量。有研究发现犬暴露于苯胺蒸气后，产生与剂量、时间相关的高铁血红蛋白血症，之后又迅速转换为血红蛋白。仅经头/鼻吸入，观察到高铁血红蛋白血症的形成情况和程度明显区别于填喂法或全身暴露。由此可见，吸入研究的结果和试验设计有关，每一种方法的优缺点都要仔细考虑。

仅经鼻暴露的优点在于暴露仅限于口和呼吸道(大鼠口不具有吸入作用)，使用样品少(效率高)，样品不易逸出，易进行间隔给药等。

经气管注入药物是观察药物经呼吸道进入机体而产生效应的方法之一。其优点是:方法简单易行，不需复杂设备，可以在一般实验室普遍采用;给药剂量较准确;药物用量少。气管注入给药法一般仅限于急性给药试验，不宜用作慢性给药，可采用经喉插入法、气管穿刺法、暴露气管穿刺法等3种方式。大鼠、豚鼠多采用经喉插入法;兔气管较粗，多取气管穿刺法。

呼吸频率是局部刺激的一个敏感指标，其变化常与浓度相关。呼吸频率的改变与刺激性化学物之间往往有剂量-效应关系。一般对上呼吸道的刺激引起呼吸频率降低，对深部呼吸道的刺激则使呼吸频率增加。

肺通气阻力增加可能是由于支气管狭窄，黏液分泌过多或呼吸道黏膜肿胀。气道阻力的测定方法主要有胸内压法和体积描记器法( body plethysmograph)。体积描记器一般分为测压式和测容式两种，测压式较常用，敏感度较高，且较易保持测定准确性，更适用于高呼吸频率时的测定。

肺顺应性可因肺纤维化而降低，而肺气肿由于失去支持性结缔组织，顺应性增加。肺顺应性测定是测定肺的弹力是否正常的一种方法，包括负压测定法和正压测定法。以单位胸腔压力下肺容量的改变来表示。

氧气和二氧化碳在肺泡-毛细血管膜上有效交换的紊乱可作为呼吸系统损伤的标记。研究发现动物试验中，只有严重的阻塞或限制性肺脏改变才表现出气体交换功能的变化。因一氧化碳与血红蛋白的亲和力是氧与血红蛋白亲和力的250倍，因而测定一氧化碳的弥散量更灵敏。在人和动物中都比较容易进行，因而被广泛地应用于呼吸系统毒理学的研究中。

药物的呼吸系统毒性反应可表现在形态学方面的变化，大体解剖和显微镜下都可以见到急、慢性的病理学改变。呼吸系统组织的石蜡切片可以满足常规的组织病理学观察，但要正确观察区分气管和肺泡内不同部位以及观察Clara细胞细胞质的改变时，则需1μm的塑料或环氧树脂切片;而要观察Ⅰ型肺泡上皮细胞或毛细血管内皮细胞的退行性改变或坏死则需要透射电子显微镜。

随着呼吸系统毒理学的发展，免疫组织化学、原位杂交和流式细胞分析等方法也广泛应用于呼吸系统毒理学的研究中，这些方法对确定肺组织中某些酶的解剖定位，对特殊的基因表达产物的研究以及对肺部细胞群的分离和鉴定均有重要意义。

肺脏毒性病理学的检查与呼吸功能和生化检查密切结合，结果相互验证是进行呼吸系统毒理学评价的主要检验指标。留取支气管和肺组织标本，制成病理组织切片，借助光学显微镜检查组织细胞的病理改变，进一步确定药物所损害的靶细胞及损害机制，可分为一般组织病理学检查和组织化学检查。某些具有细胞毒性作用的药物在肺内有一定积蓄量时，可与肺的细胞结合，产生直接的毒害作用。肺泡毛细血管与之结合后，造成该细胞变性、坏死，毛细血管壁的透性增加。常见的损伤有大叶性肺炎、小叶性肺炎、支原体肺炎和肺气肿等。

物理学检查是指超声技术及X线技术检查。它需要一定的设备，操作相对复杂，在目前尚未被广泛应用。对呼吸毒理学评价有一定的辅助作用。这种技术主要应用于大动物，也可应用于小动物。

采用支气管肺泡灌流液作为研究肺的非呼吸功能模式系统可以较深入地检测细胞和生化指标的变化，目前已成为呼吸系统毒理学中重要的体外试验方法之一，认为它比动物的呼吸功能检查敏感。支气管肺泡灌洗液( BALF)，就是用0. 9%氯化钠溶液或不含二价金属离子的缓冲液冲洗肺泡腔而得的液体。洗涤液中含有肺泡腔内原来存在的以及浸泡下来的多种成分，如酶、蛋白、巨噬细胞以及中性粒细胞( PMN)等。研究这些指标变化可敏锐地发现肺内异常。其中较常检测的指标有BALF中的总蛋白、磷脂组分、乳酸脱氢酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、脂质过氧化物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、清蛋白、乙酰神经氨酸和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以及细胞成分的变化等。

支气管肺泡灌洗技术在下呼吸道炎症反应初期作用明显，但对于病灶反应相关性不高。由于严重的炎症反应导致气管堵塞，通过肺泡灌洗可能并不能检测出最严重的组织损伤。因此，支气管肺泡灌洗技术为组织病理学检查提供了补充依据，但不能替代后者。

利用给药动物的离体气管，可评价药物对气管的作用。离体培养的气管仍能分泌黏液糖蛋白，而给药剂量可影响黏液糖蛋白的分泌水平。

将肺实质或气道切片，放入培养基中培养，可观察药物在肺中的吸收与代谢情况。而利用纤维方法从肺组织中分离的小支气管和终末细支气管，可用于研究药物对小气道细胞的影响。

目前已对呼吸系统的各种不同类型细胞进行了分离和培养，包括气管上皮细胞、肺组织和内皮细胞。细胞分离和培养技术在呼吸系统毒理学中是非常有用的工具，如气道和肺泡上皮细胞株或原代培养模型，可用于了解化学物的转运过程。已经用于呼吸系统毒理学评价的细胞有:肺泡巨噬细胞( AM)、正常人胚肺细胞( HFL)、人肺泡上皮细胞( A549)、永生化人支气管上皮细胞( BEAS-2B)、人乳头状病毒永生化的人支气管上皮细胞系( BEP2D)、兔气道平滑肌细胞( ASMC)、Clara细胞、CCL-30细胞及H441细胞系等。经研究证实，某些药物如环磷酰胺和塞替派可诱导BEAS-2B发生恶性转化。

肺灌流可分为离体灌流和原位灌流两种方式。离体灌流是将肺切下移出进行体外灌流;原味灌流是将肺保留在胸腔内灌流。通过肺动脉向肺灌流血液或血样替代物，同时肺主动通气或被动通气。药物可以加入到灌流液或吸入气中，反复灌流肺可检测药物的代谢率或肺的代谢活性。

美国FDA对开发新药的呼吸系统毒理研究提供了相应的指导性原则并对其中一些特殊问题的作了规定，以保证最大限度地减少药物的呼吸系统毒性。2005年人用药品注册技术要求国际协调会议指南ICH S7A中明确要求评价药物呼吸系统毒性的评价指标要包括呼吸道阻力、肺血管顺应性、肺动脉压、血/气分配系数、血pH等。近年来国内有关药物的呼吸系统毒理虽然有了一定的发展，但由于起步较晚以及吸入给药方法和呼吸系统毒性评价指标检测方法方面尚存在许多值得探讨和研究的问题，药物临床前呼吸系统毒性的评价和机制研究仍较为薄弱。此外，目前，由于吸入装置研制的复杂性、实际所需装置类型的多样性、装置应用效果评价指标的专一性、各类局部与全身用药特别是生物技术药物吸入剂剂型制备技术的较大难度、吸入剂长期吸入可能引起的不良反应还缺乏观察、人与动物呼吸动力学的差异性等因素，因此吸入给药的药理毒理方法学研究还需积累更多的资料，国内已用于临床的喷雾给药或吸入给药的多数药物剂型并未作过系统的吸入给药的安全性评价。国内现有的实验室也没有开展相应试验的条件。鉴于吸入制剂的特殊性、药物的活性强、直接作用于肺部并有全身吸收，因此肺部、全身安全性的吸入毒性评价显得十分有价值，很难用其他途径的安全性试验替代吸入制剂的安全性评价。

由于呼吸系统毒理学研究中使用的动物模型评估方法的复杂性，耗时长，花费大，这种方法面临着挑战，这也是替代检测方法的机遇。虽然有很多体外方法用于研究呼吸性过敏，但目前没有被广泛接受的测试系统以取代呼吸暴露研究。要取代动物模型，体外试验需确定众多条件。这些条件主要包括生物试验的细胞型、剂量和基本的试验过程等。2007年5月在柏林联邦风险评估研究院召开的由政府、从业人员和科学家共同出席的主题为呼吸毒理学的替代检测方法的会议，会议上提出了许多呼吸毒理学研究的替代方法、替代方法的研究数据、以及可能在吸入药物安全性评价中的作用。