三、几种抗结核药物的耐药机制

不同药物的作用机制不同，其产生耐药突变的基因和频率亦不同（表2-1）。

表2-1　常用抗结核药物的作用机制和耐药基因、突变频率

续表

INH：异烟肼；RFP：利福平；PZA：吡嗪酰胺；EMB：乙胺丁醇；SM：链霉素；AK/KM：丁胺卡那霉素/卡那霉素；Ofx：氧氟沙星；Cs：环丝氨酸；DNA：脱氧核糖核酸；NADH：还原型辅酶Ⅰ；RNA：核糖核酸；NAD：氧化型辅酶Ⅰ

（一）异烟肼

异烟肼（isonicotinyl hydrazide，INH，H）是在抗代谢研究中发现的一种结构简单的药物，具有对结核分枝杆菌的特异性高抗菌活性，但是其作用机制复杂，至今未能完全阐明。

异烟肼需要细菌触酶-过氧化物酶的活化，产生自由基态活化态药物，才可发挥抗结核作用。Zhang（1992）首先鉴定了编码触酶-过氧化物酶的katG基因突变是其耐药性产生的原因，并发现重组野生敏感性katG基因后，耐药突变株恢复了对INH敏感性。基因突变后的酶构型改变使细菌与异烟肼结合和活化能力下降，导致耐药性表型。在异烟肼耐药的结核分枝杆菌临床分离株中，katG基因的突变率约为50%。katG基因的突变形式有缺失、插入和错配，315编码子丝氨酸被苏氨酸、天冬氨酸和甘氨酸等置换是最常见的耐药性突变。

反应态异烟肼抑制分支菌酸生物合成酶系上，包括烯基载体蛋白还原酶（inhA）和β-酮酰基载体蛋白合成酶（kasA）。但是活化态INH并非直接作用在inhA酶上，它需要和辅酶Ⅰ结合成异烟酰还原型Ⅰ加成物，然后和inhA酶结合并抑制其酶活性，阻碍分支菌酸合成。异烟肼耐药菌株中也鉴定到kasA基因突变，其意义尚需进一步鉴定。katG和（或）inhA基因突变约占异烟肼临床耐药菌株70%。

但是，仍有一些触酶阳性的异烟肼耐药菌株不存在katG、inhA和kasA突变，提示存在其他基因参与耐药性表达的情况。烷基氢过氧化物还原酶（ahpC）是分枝杆菌的氧化应激反应的另一个可能成员，可还原过氧化物产物，保护核酸、未饱和脂肪酸等敏感靶位免于氧化，因此编码基因ahpC可能是直接失活异烟肼。在一些触酶阴性的INH耐药临床野生株中也分离到ahpC基因启动子代偿性突变，而在敏感菌株中未发现ahpC基因突变。可见，氧化应激系统功能的损伤可能是结核分枝杆菌对异烟肼高敏感性的原因。有报道指出，结核分枝杆菌也存在和人体中失活INH一样的由nat基因编码的芳香胺乙酰转移酶，乙酰化失活INH。

此外，触酶产生的氧自由基对DNA、糖类和脂类等多个细胞靶位的多效应作用也参与了INH抗结核作用。

由上可见，异烟肼敏感性有多基因参与，这也和异烟肼耐药水平离散是一致的。

INH仅对结核分枝杆菌敏感，而对非结核分枝杆菌表现天然耐药，其原因可能和以下因素相关：①结核分枝杆菌有着较高的katG酶活性；②结核分枝杆菌分支菌酸合成靶酶有着较高的敏感性；③结核分枝杆菌缺乏输出泵或其功能微弱；④结核分枝杆菌缺乏或较弱的抗氧自由基氧化作用；⑤非结核分枝杆菌有更强的乙酰化失活INH活性。

（二）利福平

研究表明，利福平（rifampicin，RFP）的作用靶位是DNA依赖性RNA多聚酶。此酶有4个亚基（2αβ β'）。聚合酶亚基重组实验证明，利福平的结合靶位是β亚基。利福平和β亚基蛋白结合后，阻碍信使RNA合成的起始，影响转录过程的继续，最终阻断结核分枝杆菌蛋白合成。β亚基蛋白（RpoB）编码基因rpoB的突变是利福平耐药性的主要原因。近年来，采用聚合酶链反应-单链构象多态性和测序等技术发现，突变是在rpoB基因核心区域，多为插入、缺失等碱基突变。发生突变频率最高的是氨基酸编码子531（丝氨酸→亮氨酸），约占突变的41%，其次为526编码子（组氨酸→酪氨酸），约占36%，其他一些编码子也发生突变。目前为止，96%以上的临床分离利福平耐药菌株是rpoB基因突变的结果。因此，利福平耐药基因检测最有希望成为临床耐药性基因检测方法。

利福平是一步突变耐药类型，rpoB突变部位和耐药水平高低、利福霉素类之间的交叉耐药性有关。511编码子的亮氨酸被脯氨酸置换，522编码子的苏氨酸被亮氨酸置换可导致对利福平的耐药，但对利福喷汀和另一衍生物KRM1648敏感，说明还存在其他作用机制。

（三）吡嗪酰胺

吡嗪酰胺（pyramide，PZA，Z）在pH5.5的酸性环境下显示对结核分枝杆菌特异性抗结核活性。吡嗪酰胺也是一种前体药物。在酸性环境中，吡嗪酰胺在细菌胞浆内经吡嗪酰胺酶作用转化成有抗菌活性的吡嗪酸（pyrazinoic acid，POA）。吡嗪酸由外排机制排出菌体外，在酸性环境下质子化后返回细胞。当内向流通量大于外向流通量，菌体内吡嗪酸累积，引起胞浆酸化，多种酶活性抑制。但是，至今在临床中未分离到对吡嗪酸耐药菌株，也未发现吡嗪酸和结核分枝杆菌蛋白结合，此机制仍待验证。

研究发现，72%结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药菌株存在编码吡嗪酰胺酶的pncA基因突变、缺失或置换，也存在一部分吡嗪酰胺酶阴性PZA耐药菌株。但pncA突变有高度多形性，虽然存在某种程度的簇化区，但突变沿着整个基因离散，增加了诊断基因突变的难度。其他分枝杆菌对吡嗪酰胺的不敏感性或是由于吡嗪酰胺酶活性微弱（如堪萨斯分枝杆菌），或虽有高度活性吡嗪酰胺酶，但具有较强的外排机制，胞内无足够的吡嗪酸累积（如耻垢分枝杆菌）。

（四）乙胺丁醇

一般认为，乙胺丁醇（ethambutol，EMB，E）作用在胞壁合成支路上，抑制葡萄糖转化成阿拉伯糖酸和阿拉伯半乳聚糖转运至细胞壁，引起单或双海藻糖分支菌酸堵塞堆积。在结核分枝杆菌等其他分枝杆菌中鉴定到一组编码阿拉伯糖转移酶基因embA、embB和embC。结核分枝杆菌临床乙胺丁醇耐药菌株中65%以上与emb基因及基因间隔区突变有关，并和高耐药水平相关。突变酶构象改变，影响酶和乙胺丁醇结合而导致耐药表型出现。

（五）链霉素

链霉素（streptomycin，SM）发现于20世纪40年代，60～70年代的研究发现链霉素是一步突变药物。亚基重组试验表明，链霉素结合在核糖体的30S亚基S12多肽上，造成氨基酸掺入的错译，得到异常蛋白，阻碍了正常代谢。因此，30S亚基S12的编码基因rpsL突变是结核分枝杆菌链霉素耐药性的主要机制。遗传研究同时发现，16SrRNA编码基因rrs突变也介导其对链霉素的耐药性，rpsL和rrs基因表达出中高度耐药水平。临床链霉素耐药菌株中，rpsL和rrs基因突变分别占50%和20%左右。因此，仍有其他基因参与链霉素耐药性。rspL的42编码子的赖氨酸被天冬氨酸、苏氨酸置换是最常见的突变。rrs的耐药突变常见于530和915编码子区域。

（六）氟喹诺酮

虽然在开发研究中氟喹诺酮显示了抗结核活性，但它仍是作为一般抗菌药物开发的。近年来，耐药结核病（特别是MDR-TB）流行，提高了氟喹诺酮二线药物的地位。氟喹诺酮有着多靶位作用特点，包括回旋酶（由GyrA和GyrB亚基构成）、拓扑异构酶和通透性膜蛋白等，高水平耐药需要多基因突变积累。

回旋酶gyrA亚基编码基因gyrA可决定自然敏感性水平。gyrB基因也和大肠杆菌的氟喹诺酮耐药性相关。虽然在实验室获得了gyrB耐药突变体，但是在临床分离株中尚未见gyrB突变结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药菌株。70%的临床结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药菌株是gyrA突变的结果，94编码子的天冬氨酸被丙氨酸、天冬酰胺、组氨酸、酪氨酸等所置换突变占耐药突变株的42%。

（七）环丝氨酸

环丝氨酸（cycloserine，Cs）是一种结核分枝杆菌的抑菌剂，其作用机制为竞争性阻止丙氨酸和丙酰胺-丙氨酸结合，抑制细菌细胞壁黏肽的合成，从而使细胞壁缺损。环丝氨酸耐药性产生缓慢，且不与其他药物存在交叉耐药。分子生物学研究显示，D-丙氨酸外消旋酶的编码基因alrA的启动子单一胆碱GT的突变，可使D-丙氨酸外消旋酶上调表达，导致环丝氨酸耐药。

总之，耐药机制及耐药基因的研究自然导致新药设计和耐药性基因诊断概念和方法的产生。目前已经有多种分子生物学方法通过检测耐药基因型而鉴定耐药菌的方法，包括聚合酶链反应-单链构象多形性（polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）、固相序列扫描和生物芯片等。这些方法由于摒弃生长依赖性，获得数日报告结果的快速性。但是，这些方法尚存在一些限制，如一些药物耐药机制尚未全部阐明，一些药物由于多基因、多突变部位，特别是非簇化的离散突变，基因突变点的检测成为庞大的系统。同时，所有靶基因的突变都包含非耐药相关突变，干扰着耐药基因作为其耐药表型的检测。但是，由于利福平耐药性MDR判定的标志性意义和耐药靶位基因及其突变区位的集中，依据分子生物学技术研发的利福平耐药性快速诊断方法可靠，成为筛查耐药结核的辅助工具。

应该指出，大多数耐药突变并未得到遗传学的支持，不能将耐药表型株中检出的突变全部等同于耐药性突变，应该还存在其他无关突变。进一步说，基因性不等于表型，其表达与否和表达程度可决定表型表达。耐药结核病的诊断是临床诊断，需要结合患者的病史特点，对已经开展的治疗反应、实验室传统药敏试验及分枝杆菌快速检测结果进行综合判断，给出近似正确的诊断。